细胞凋亡是一个高度保守的对正常发育和组织稳态至关重要的过程。成人体内每天大约有五千万到七千万细胞经历细胞凋亡,无限制的细胞凋亡具有严重的病理后果,因此体内细胞凋亡受到严格管控。癌症是一种细胞因损伤或恶变而获得无限增殖能力的疾病,而逃避细胞凋亡是癌细胞的重要特征之一。在过去三十年中,研究已阐明癌细胞中细胞凋亡抑制的机制,这为研究靶向细胞凋亡的疗法奠定了基础。目前研究较成熟的细胞凋亡通路有两条:死亡受体介导的外源性凋亡通路和线粒体介导的内源性凋亡通路。其中,Bcl-2家族蛋白作为关键地细胞凋亡调节因子之一,在线粒体凋亡通路中发挥重要作用。研究发现,肿瘤细胞通过过表达抗凋亡Bcl-2蛋白或低表达促凋亡Bcl-2蛋白来逃避细胞凋亡,因此,通过靶向抗凋亡Bcl-2蛋白(如抗凋亡Bcl-2蛋白抑制剂)或重新激活促凋亡Bcl-2蛋白(如组蛋白去乙酰化酶抑制剂)可诱导细胞凋亡,进而杀死肿瘤细胞。新型抗凋亡Bcl-2蛋白抑制剂研究目前已报道的抗凋亡Bcl-2蛋白抑制剂大多为BH3模拟物,即通过模拟BH3-only蛋白的BH3结构域与抗凋亡Bcl-2蛋白的疏水性结合腔间特异性结合,干扰抗凋亡和促凋亡Bcl-2蛋白之间的蛋白-蛋白相互作用。酪氨酸衍生物41是本课题组过去研究制备的一个化学合成中间体,近期发现该化合物对Bcl-2蛋白具有一定的亲和力(Ki=8.4 μM),适合作为先导化合物进行深入结构改造。分子对接结果显示,41占据Bcl-2蛋白BH3疏水结合腔的p3和p4 口袋,而结构中苯磺酰胺部分的苯环朝向p2 口袋,但并未与之结合。结合分子对接结果以及文献报道的Bcl-2蛋白抑制剂的构效关系,我们保留了先导化合物41的酪氨酸骨架和苯磺酰胺部分,在苯磺酰胺部分的苯环上引入取代基(硝基和R2),以期增加化合物与p2 口袋的结合,提高化合物与Bcl-2蛋白的亲和力。其次,我们根据药物化学的生物电子等排原理和同系原理将先导化合物41结构中的联苯基团替换为取代苯基(R1)、Boc替换为各种酰基(R3),考察这两部分对化合物与Bcl-2蛋白的亲和力的影响。通过上述对先导化合物41的结构改造我们设计合成了一系列酪氨酸衍生物(series A)。此外,我们应用构象限制性原理,将酪氨酸骨架进行芳香氨基酸侧链环化,以实现对先导化合物的骨架跃迁,设计合成了一系列四氢异喹啉类衍生物(series B)。与series A设计思路类似,我们在苯磺酰胺部分的苯环上引入取代基(硝基、R3),以期增加化合物与p2 口袋的结合,增强化合物与Bcl-2蛋白的亲和力;根据药物化学生物电子等排原理和同系原理将先导化合物41结构中的联苯基团替换为烷基和取代苯基(R1)、Boc替换为各种烷基(R2),考察这两部分对化合物与Bcl-2蛋白的亲和力的影响。对合成的seriesA和seriesB系列目标化合物,我们首先采用荧光偏振法测定其对Bcl-2蛋白的亲和力,然后选取代表化合物测定其对Bcl-XL和Mcl-1蛋白的亲和力,探讨目标化合物对Bcl-2家族蛋白的选择性;同时采用MTT法测定代表化合物抗细胞增殖能力;根据上述实验结果,选取化合物测定其诱导细胞凋亡及caspase-3活化的能力。测试结果显示,部分目标化合物对Bcl-2蛋白的亲和力明显提升,14个series A化合物和14个series B化合物的活性优于先导化合物41,其中A3、A24、A28、B25和B26等目标化合物的活性优于阳性对照棉酚。对series A化合物而言,Boc基团对目标化合物与Bcl-2蛋白的亲和力有很大影响。去除Boc基团后,相应目标化合物与Bcl-2蛋白的亲和力丧失,如A14-A19;而当Boc被类似的酰基替换后,相应目标化合物与Bcl-2蛋白的亲和力保持或提高,如A20-A28。总体而言,苯磺酰胺苯环上取代基取代有利于相应目标化合物与Bcl-2蛋白的亲和力,如A3、A24和A28等;但是对位环烷基氨基类取代基除外,该类取代基将导致相应目标化合物与Bcl-2蛋白的亲和力丧失,如A8、A9和A27。相对而言,联苯部分的变化对相应目标化合物与Bcl-2蛋白的亲和力影响不大,如A1 vs A3 vs A5、A6 vs A7 和 A24 vs A28。对series B化合物而言,当X为氢原子(B1-B5)或者R3为各种胺基(B10-B12,B18,B27-B29)时,相应目标化合物对Bcl-2蛋白亲和力基本丧失;R1为取代苄基的目标化合物(如B9、B19和B25)对Bcl-2蛋白的亲和力优于R1为丙基的目标化合物(B6和B7);R2的变化对相应化合物对Bcl-2蛋白的亲和力影响不大,但是4-苯基苄基除外,该取代基将导致相应化合物对Bcl-2蛋白亲和力基本丧失(如B13 和 B20)。研究发现,代表化合物A1、A24、A28、B19、B21、B25和B26对Mcl-1蛋白也具有良好的亲和力,其中A28、B25和B26对Mcl-1蛋白的亲和力优于阳性对照棉酚;上述化合物与Bcl-XL蛋白亲和力较差。代表化合物A1、A24、A28、B25和B26对肿瘤细胞均表现出一定的抗细胞增殖活性,而对正常细胞的抗增殖活性较差,表现出一定的肿瘤细胞选择性;其中,A28的抗细胞增殖活性与阳性对照棉酚相当。进一步的研究表明,代表化合物A28和B25可剂量依赖性诱导Jurkat细胞细胞凋亡;10 μM和20 μ浓度的A28诱导Jurkat细胞48 h分别可导致6.2%和22.2%的细胞凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡),而DMSO对照组的凋亡率只有2.6%;15 μM和30 μM浓度的B25诱导Jurkat细胞48 h分别可导致7.3%和21.3%的细胞凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡),而DMSO对照组的凋亡率只有3.2%。此外,A28和B25还可剂量依赖性诱导Jurkat细胞中caspase-3的活化。新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂研究前期我们在原有结构类型基础上,设计合成了一系列2,6-二取代嘌呤类组蛋白去乙酰化酶抑制剂,初步活性研究发现,部分化合物具有与阳性对照SAHA相当甚至更好的体外组蛋白去乙酰化酶抑制活性,遗憾的是这些化合物的体外抗肿瘤增殖活性一般;活性最优化合物H5r对HeLa细胞提取物(主要含HDAC1和HDAC2)的IC50值为0.075 μM。我们以化合物H5r为先导化合物,运用生物电子等排原理将酶表面识别区的2,6-二取代嘌呤母核以2,9-二取代嘌呤替换,在嘌呤2位引入氯、氨基、取代胺基、吗啉和磺酰胺基,9位引入各种烷基,考察相应2,9-二取代嘌呤作为酶表面识别区对化合物活性的影响;同时运用同系原理改变连接臂的长度,将连接基团的-CH2CONH-简化为-NH-,考察连接臂的长度对化合物活性的影响。通过上述结构改造我们设计合成了一系列新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂(series C)。对合成的series C化合物,我们首先测试了其体外抑酶活性,并且选取活性较好的化合物进一步测定了其对HDAC2和HDAC8亚型的抑制活性;其次,采用MTT法测定代表化合物抗肿瘤细胞增殖的能力;根据上述实验结果,选取代表化合物进行western blot实验检测其对组蛋白H3乙酰化水平的影响;此外,我们还测定了代表化合物诱导细胞凋亡及caspase-3活化的能力。测试结果表明,9个目标化合物表现出与阳性对照SAHA相似或更优的抑酶活性,其中目标化合物C9、C13和C14活性最佳,IC50值分别为30 nM、26 nM和27nM。连接臂的长度和嘌呤环的取代基对相应化合物的抑酶活性均有影响。连接臂较短的化合物(C1-C5和C21)抑酶活性较差,而连接臂为5或6个亚甲基时,相应化合物的抑酶活性较好(C6-C20、C22-C25);当嘌呤环2位为氨基或氯时,相应化合物的抑酶活性要优于其它化合物,例如C13 vs C19和C12 vs C24,而且嘌呤环2位取代基越大时,相应化合物的抑酶活性越差;当嘌呤环9位有取代时,相应化合物的抑酶活性要优于此处无取代的化合物,例如C7 vs C6和C9 vs C8。此外,代表化合物C9、C13和C14对HDAC2的抑制活性优于HDAC8。代表化合物C9、C13和C14对肿瘤细胞均表现出一定的抗细胞增殖活性,其中化合物C13对所测三株肿瘤细胞的抗细胞增殖活性均优于阳性对照SAHA。此外,western blot实验表明目标化合物C13可剂量依赖性升高KG1细胞中组蛋白H3乙酰化水平,验证了该化合物的HDAC靶向性。此外,研究表明C13可剂量依赖性诱导KG1细胞细胞凋亡:1μM和2 μM浓度的C13诱导KG1细胞24 h分别可导致20.7%和50.2%的细胞凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡),而DMSO对照组的凋亡率为14.2%;C13还可剂量依赖性诱导KG1细胞中caspase-3的活化。综上所述,研究新型的药物启动肿瘤细胞凋亡是近年抗癌药物领域的新兴研究方向。围绕肿瘤细胞的抗凋亡机制,我们设计合成了两个系列抗凋亡Bcl-2蛋白抑制剂(series A和B)和一个系列组蛋白去乙酰化酶抑制剂(series C),期间共合成个了 147新化合物,其中新中间体65个,新结构目标化合物82个。相应目标化合物已经1HNMR、13CNMR和HRMS结构确证,并进行了熔点和纯度的测定。相关的生物活性研究表明,部分化合物能够有效的通过诱导细胞凋亡杀死肿瘤细胞,这为课题组今后开发更高效的促进肿瘤细胞凋亡的新型抗癌药物奠定了基础。