隐孢子虫是属于顶复门的胞内寄生性原虫,可引起全世界范围内的人和动物腹泻病。其中能感染人的主要是人隐孢子虫(C.hominis)和微小隐孢子虫(C.parvum)。前者主要感染人,而后者还可感染其他动物。P30蛋白是通过半乳糖亲和层析法从微小隐孢子虫和人隐孢子虫的子孢子中分离出来的一种约30 kD的Gal/GalN.Ac特异性凝集素。此蛋白定位于微小隐孢子虫子孢子和胞内阶段虫体的顶端表面,介导虫体的粘附及侵入。本研究将从微小隐孢子虫基因组中克隆Gal/GalNAc特异性凝集素p30基因并构建原核表达载体,表达融合His标签的P30蛋白后进行免疫学鉴定。本研究为今后隐孢子虫疫苗的研制奠定了基础。　　 目的：　　 1通过对微小隐孢子虫Gal/GalNAc特异性凝集素p30基因的T-A克隆及测序,利用生物信息学方法分析其结构和功能,从而为下一步表达载体的构建提供基因材料。　　 2通过构建含微小隐孢子虫p30基因的原核表达载体,获得隐孢子虫Gal/GalNAc特异性凝集素P30融合蛋白,并对其进行免疫学鉴定,从而为今后隐孢子虫疫苗的研制奠定基础。　　 方法：　　 1隐孢子虫p30基因的克隆及特性分析　　 1.1蔗糖分离和纯化微小隐孢子虫卵囊,提取基因组DNA后PCR扩增p30基因。　　 1.2T-A克隆后测序鉴定,BLAST同源性分析,并对其物理化学性质及其推导的蛋白质二级结构和抗原表位进行预测。　　 2隐孢子虫p30基因原核表达系统的构建　　 2.1 EcoR I和Xho I双酶切重组p30的T载体。　　 2.2将p30基因亚克隆至pET-28a(+)表达载体后转入E.coli Rosetta宿主菌中。　　 2.3用诱导剂IPTG对重组蛋白P30进行诱导表达。　　 3重组P30融合蛋白的纯化及鉴定　　 3.1使用Ni离子亲和层析柱纯化重组质粒pET-28a(+)-p30表达产生的含组氨酸的重组蛋白,SDS-PAGE鉴定其纯度。　　 3.2对纯化蛋白进行透析复性后,紫外分光光度法测定其浓度。　　 3.3 Western blotting鉴定重组蛋白P30的免疫学特性。　　 结果：　　 1 PCR扩增得到特异的微小隐孢子虫p30基因,测得的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与GenBank上提交的微小隐孢子虫p30基因序列同源性分别为98％～100％和99％～100％。预测的P30蛋白具有9个潜在的抗原表位。　　 2成功构建Gal/GalNAc特异性凝集素p30基因的原核表达系统,克隆载体和表达载体中目的基因的测序结果完全相同。　　 3表达产物主要存在于包涵体中,其相对分子质量约为34 kD,纯化后的重组蛋白能被感染微小隐孢子虫的牛血清特异性识别,提示重组蛋白P30具有良好的免疫反应性。　　 结论：　　 本实验成功构建含微小隐孢子虫p30基因的原核表达载体pET28(+)-p30,IPTG诱导表达出与理论大小相一致的重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析法纯化,制备出高纯度的融合蛋白,Western blotting鉴定后,重组蛋白表现出良好的免疫反应性。该实验为进一步研究针对微小隐孢子虫的诊断靶标及疫苗抗原的筛选奠定基础。