论文部分内容阅读
第一部分：tmTNF-α反向信号在乳腺癌内分泌耐药中的作用 跨膜型肿瘤坏死因子alpha(transmembrane tumor necrosis factor alpha, tmTNF-α)既可作为配体,与靶细胞TNFR结合,向靶细胞传递正向信号,对靶细胞发挥效应;又可作为受体,与可溶性或膜TNFR结合,向效应细胞自身传递反向信号,介导效应细胞的生物学效应。本室前期工作证实肿瘤细胞高表达tmTNF-α,可通过其反向信号保护肿瘤细胞抵抗分泌型TNF-α(secretory tumor necrosis factor alpha,sTNF-α)诱导的凋亡;同时证明高表达TNF-LS诱导MCF-7细胞抵抗sTNF-α的胞毒作用,也诱导其抵抗化疗。那么,tmTNF-α是否也能通过其反向信号诱导乳腺癌细胞抵抗内分泌治疗呢?如是,其机制如何?这些问题迄今未见到相关报道。 本研究通过将tmTNF-α及其反向信号相关突变体转染至MCF-7乳腺癌细胞,证实tmTNF-α反向信号与内分泌治疗耐药之间的关系,并阐明其分子机制。为提高乳腺癌对内分泌治疗的敏感性提供实验依据,为乳腺癌和其它肿瘤的治疗提供新的思路和靶点。 主要结果如下: 1.tmTNF-α反向信号导致MCF-7细胞内分泌治疗耐药:MCF-7细胞几乎不表达TNF-α,将wtTNF-α及其突变体转染至MCF-7细胞,用tamoxifen作用48 h,结果证实转染tmTNF-α或TNF-LS使tamoxifen对MCF-7细胞生长抑制明显低于转染wtTNF-α及对照细胞。提示tmTNF-α反向信号导致MCF-7细胞对内分泌治疗耐药。 2.tmTNF-α反向信号导致MCF-7细胞NF-κB组成性活化:稳转TNF-LS可导致MCF-7细胞的IκB明显降解,tamoxifen并不能明显影响TNF-LS的作用。提示tmTNF-α反向信号导致MCF-7细胞NF-κB组成性活化。 3.NF-κB抑制剂可逆转tmTNF-α反向信号介导的内分泌治疗耐药性:用tamoxifen作用于MCF-7细胞和MCF-7/TNF-LS稳转细胞后,MCF-7/TNF-LS稳转细胞的生长抑制率明显低于对照组;NF-κB抑制剂可完全阻断tmTNF-a反向信号介导的MCF-7细胞对内分泌治疗的耐药性,使之对Tamoxifen的敏感性明显增加。提示tmTNF-α反向信号可能通过活化NF-κB导致MCF-7细胞对内分泌治疗发生耐药。 4.tmTNF-α磷酸化位点突变体构建:为进一步研究tmTNF-a反向信号介导乳腺癌细胞发生内分泌治疗耐药,我们构建了三种突变体:(1)构建-75位丝氨酸点突变重组体pIRES2-EGFP-S-75R tmTNF-a;(2)构建-72位丝氨酸点突变重组体pIRES2-EGFP-S-72R tmTNF-a;(3)构建-75与-72位丝氨酸同时点突变重组体pIRES2-EGFP-S-75R/S-72R tmTNF-a。 5.tmTNF-α-72位磷酸化位点突变逆转MCF-7细胞对内分泌治疗耐药:(1)将上述不同突变体转染至MCF-7细胞,-72位点突变或两个丝氨酸同时突变明显抑制tmTNF-α诱导的IκB降解,而-75位点突变则无效应。提示-72位丝氨酸在tmTNF-α反向信号介导的内分泌治疗耐药中发挥重要作用;(2)转染tmTNF-α使MCF-7细胞对tamoxifen明显耐药,而转染S-72R tmTNF-α则可提高MCF-7细胞对之的敏感性;(3)转染S-72R tmTNF-α可阻断tmTNF-α导致的IκB降解, tamoxifen对之无明显影响;(4)应用NF-κB抑制剂可恢复转染tmTNF-α的MCF-7细胞对内分泌治疗的敏感性。 第二部分：pEGFP-N1-His-TNF-LS构建 TNF-α是具有免疫调节和抗肿瘤等多种生物学效应的细胞因子,具有两种活性形式:跨膜型TNF-α和分泌型TNF-α。tmTNF-α是sTNF-α的前体,在N端比sTNF-α多了76个氨基酸的信号肽(leader sequence, LS)。研究表明,TNF-LS不但介导tmTNF-α反向信号,而且其胞内段可被SPPL2a/2b水解,入核,诱导某些基因表达。而我们前期结果表明,用针对TNF-LS胞外段的抗体检测肿瘤组织对tmTNF-α的表达,发现胞核可着色,提示TNF-LS可能内化入核。 为证实上述设想,本研究构建pEGFP-N1-His-TNF-LS融合表达载体,使TNF-LS的胞内段端带有His标签,胞外段与EGFP融合表达,为后续利用免疫荧光在胞内追踪和定位奠定基础。 主要结果如下: 1.重组体的构建和克隆:以pIRES2-EGFP-TNF-LS质粒为模板,用加入His标签的引物以PCR的方法扩增出目的片段His-TNF-LS,用BamH I和EcoRI对目的基因和pEGFP空载体双酶切,再用T4 DNA连接酶连接,获得pEGFP-N1-His-TNF-LS重组质粒,将连接产物转化DH5α,挑取阳性克隆鉴定。 2.阳性克隆的鉴定:用菌落PCR筛选阳性克隆,然后用上述限制性内切酶进行双酶切鉴定,结果显示,重组质粒经过酶切得到了约250bp左右的目的片断,与连接的目的基因的大小一致。经DNA测序分析,证实重组体突变成功。