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新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)为单股负链不分节段的RNA病毒,由于其基因组较大,约15 kb,直接在全长基因组中进行分子操作存在技术困难,对NDV复制转录的机制及相关蛋白功能的研究会产生巨大障碍。故采用微型基因组(Minigenome)技术,即用报告基因替代病毒编码区,只保留与病毒基因复制和转录相关的基本调控序列。NDV基因组的复制和转录依赖于RNP复合物的NP、P和L三种蛋白,其它的病毒蛋白可能会与RNP复合物发生相互作用,而其是否参与调控病毒复制和转录所知甚少。本研究设计了四种微型基因组方案,通过对不同方案进行验证,明确了微型基因组构建过程所需要的序列信息及插入方式,同时比较了在不同启动子下表达效率的差异。此外,对基础微型基因组平台进行特殊改造,创建了复制缺陷型微型基因组,并对M、V及W蛋白对病毒复制与转录过程的影响进行了初步研究。主要的研究结果如下:1.四种NDV微型基因组的构建。设计方案:(1)按照模拟病毒基因组的方式,将报告基因EGFP反向插入,两侧分别为5’Trailer与3’Leader的调控序列,命名为Mini;(2)在Mini基础上,缺失相应的GE、GS及UTR序列,命名为Mini2;(3)按照构建感染性克隆的方式,将EGFP正向插入,两侧分别为5’Leader与3’Trailer的调控序列,命名为MG;(4)在MG基础上,缺失相应的GE、GS及UTR序列,命名为MG2。四种微型基因组分别克隆在含T7启动子的pUC19载体中,与NP、P、L及T7 RNA聚合酶表达质粒共转染BHK-21细胞分析EGFP的表达,发现仅Mini具有功能性。结果表明报告基因只能反向插入,GE-5’UTR、3’UTR-GS是微型基因组必不可少的基因元件。2.两种启动子对微型基因组表达效率的影响。将Mini微型基因组分别克隆到含T7启动子与鸡β-actin启动子的载体中,分别为pUC19-Mini-EGFP与pCAGGS-Mini-EGFP。通过对表达效率的分析,结果发现T7启动子远高于鸡β-actin启动子。3.复制缺陷型微型基因组的构建。为了独立研究病毒的复制与转录两个过程,将微型基因组5’端Trailer序列缺失,导致病毒基因组(vRNA)复制产生3’端缺失Trailer(ΔT)的cRNA,ΔT cRNA将不能启动复制产生vRNA,以此可以区分基因的复制与转录过程,命名为pUC19-Mini-ΔT。4.M、V和W蛋白对病毒复制和转录调控的作用。为了定量报分析报告基因的表达,在正常(复制敏感型)与复制缺陷型的两种微型基因组中采用萤火虫荧光素酶报告基因,分别命名为pUC19-Mini-Lu和pUC19-Mini-ΔT-Luc。将M、V和W表达质粒与两个系统分别共转染细胞,分析萤火虫荧光素酶活性,结果显示仅V蛋白对病毒基因组的转录有抑制的作用,而M和W蛋白没有影响。综上所述,明确了微型基因组的构建方式,并对微型基因组的表达进行了的优化。同时利用正常与复制缺陷型的两种微型基因组,确定了V蛋白对病毒的转录有影响。本研究为了解NDV基因组的复制与转录及相关蛋白的作用奠定了基础。