顺铂是治疗包括卵巢癌在内的多种恶性肿瘤的一线药物,但多数晚期卵巢癌患者会对铂类药物产生抗性。因此,如何增加顺铂的敏感性是人们关注的问题。自噬(autophagy)是细胞内重要的降解途径,通过形成自噬溶酶体降解损伤的蛋白以及细胞器。这一完整的过程也称为自噬流量(autophagic flux)。尽管细胞自噬是一把双刃剑,但目前研究证实肿瘤细胞的自噬能够拮抗化疗药物的作用,自噬水平的增加可能与肿瘤对化疗药物敏感性下降有关。然而在临床上很难评价卵巢癌患者肿瘤组织中自噬水平的高低,这给靶向细胞自噬治疗肿瘤带来了困难。p62是自噬的受体蛋白之一。以往的研究证实p62在包括卵巢癌在内的多种恶性肿瘤中高表达。本实验组的前期工作发现卵巢癌顺铂耐药SKOV3/DDP细胞原发性高表达p62,且自噬水平较高;进一步研究发现,原发性高表达的p62通过ZZ结构域活化了促存活的NF-κB信号通路,降低了卵巢癌细胞的顺铂敏感性。然而,当给予卵巢癌细胞自噬抑制剂氯喹或巴弗罗霉素时,细胞的顺铂敏感性明显增加,而此时p62的表达量也显著增高(诱导性p62)。这些结果提示,当细胞处于高水平的自噬时,p62发挥促存活作用;反之,当自噬流量受阻,p62可能发挥促死亡作用。表明不能仅仅依靠表达量来判断p62在卵巢癌中的作用,细胞的自噬水平(自噬流量)可能是决定p62发挥促存活还是促死亡作用的关键。因此需要进一步探究p62与自噬之间的调控关系。p62具有丰富的蛋白结合序列,包含了UBA(泛素化蛋白结构域),LIR(自噬体膜LC3结合序列),ZZ(锌指结构域)等功能性结构域。因此,p62作为一个“信号枢纽”,通过与不同蛋白的交互作用决定了其参与细胞存活信号还是凋亡信号。Caspase 8是经典的外源凋亡信号启动子。目前研究证实,Caspase 8在恶性度高的卵巢癌细胞中低表达;抑制卵巢癌细胞中Caspase 8的表达能够降低细胞对化疗药物的凋亡敏感性。除了蛋白酶体系统以外,自噬也参与了Caspase 8的活化和降解。提示通过探讨p62在Caspase 8介导的凋亡通路中的作用,可能有助于阐明抑制自噬增加顺铂等化疗药物敏感性的机制。本实验从p62的功能性结构域入手结合体内外实验,通过探讨自噬抑制导致的p62累积在顺铂诱导的Caspase 8活化中的作用,阐明自噬与凋亡的调控机制,为靶向自噬治疗卵巢癌提供依据。方法:一、构建A2780荷瘤小鼠模型,设置空白对照组(给予PBS),顺铂单独给药组(给予3mg/kg顺铂),自噬抑制剂氯喹单独给药组(给予35mg/kg氯喹)以及顺铂和氯喹联合治疗组。通过免疫组织化学染色检测各组p62蛋白的表达、试剂盒法检测Caspase 8的酶活性、TUNEL染色检测凋亡率。二、构建野生型p62以及UBA和LIR结构域突变的p62质粒,转染卵巢癌SKOV3细胞,开展以下实验:1.SKOV3细胞转染野生型p62以及p62蛋白UBA结构域突变体,MTT法检测各组细胞对顺铂的敏感性差异。2.选用6μg/ml顺铂作用细胞24h,通过AnnexinV/PI染色流式细胞术、Hoechst染色、Caspase 3/7酶活性检测细胞凋亡情况。3.6μg/ml顺铂作用细胞12h,通过酶活性试剂盒以及Western Blot法检测Caspase 8的活化情况。4.评价各组细胞在顺铂刺激下自噬水平的差异。分别导入野生型p62以及UBA、LIR结构域突变的p62蛋白,6μg/ml顺铂作用细胞12h,利用1%Triton-SDS分离细胞总蛋白,检测不可溶(Insoluble)泛素化蛋白的表达;通过mCherry-GFP-LC3串联病毒构建SKOV3细胞稳转细胞系,检测各组细胞的自噬流量;利用DQ-BSA法评价通过自噬-溶酶体途径降解的蛋白量。5.SKOV3细胞分别导入野生型p62以及UBA、LIR结构域突变的p62蛋白,顺铂作用12h后,通过免疫共沉淀法以及免疫荧光法检测p62、LC3与Caspase 8的结合情况。构建并纯化野生型p62、UBA以及LIR突变体的GST融合蛋白,在卵巢癌荷瘤小鼠肿瘤组织中检测p62与Caspase 8、LC3的结合。三、通过免疫组织化学染色检测160例卵巢癌患者肿瘤组织中p62与Caspase8的表达,统计蛋白表达量与生存期,TNM分期、复发风险等临床特征的相关性。结果:1.免疫组织化学染色结果发现,与顺铂单独治疗组相比,自噬抑制剂氯喹与顺铂联合治疗促进了p62在肿瘤组织中的表达;同时,顺铂与氯喹联合治疗组Caspase 8的酶活性显著增强;TUNEL染色阳性率增加。2.MTT结果表明,与过表达野生型p62相比,导入p62蛋白UBA结构域突变体后SKOV3细胞的顺铂敏感性降低。3.凋亡实验结果显示,与过表达野生型p62相比,导入p62蛋白UBA结构域突变体后,在相同剂量的顺铂刺激下,SKOV3细胞Annexin V/PI染色阳性率降低;染色质浓染,细胞核碎裂等具有凋亡特征的细胞数量减少;Caspase 3/7的酶活性降低。同时Caspase 8的切割以及酶活性受到抑制。4.评价各组细胞自噬水平发现,导入p62蛋白UBA和LIR突变体后,细胞内非可溶形式(Insoluble)的泛素化蛋白聚集体减少;细胞中代表晚期自噬溶酶体的红色荧光增加,同时代表未成熟的自噬体的绿色荧光降低;同时,SKOV3细胞导入p62两种突变体后,DQ-BSA的荧光强度增加。以上结果表明,p62蛋白的UBA和LIR结构域突变增加了细胞的自噬流量。5.免疫荧光和免疫共沉淀结果表明,与过表达野生型p62相比,UBA和LIR结构域突变体显著抑制了Caspase 8与LC3的结合;GST-pull down实验表明,p62蛋白UBA以及LIR结构域突变体显著抑制了p62与Caspase8以及LC3的结合。6.斯皮尔曼相关性分析结果显示,在160例卵巢癌患者中,p62与Caspase8的表达存在相关性(pho=0.499,P<0.01);联合分析p62和Caspase8的表达发现,53例患者同时高表达p62和Caspase 8,且与p62单独高表达相比,p62/Caspase8共同高表达患者的生存时间更长(P=0.22),肿瘤恶性程度和复发率更低。结论:1、体内体外实验共同证实自噬抑制促进了顺铂对Caspase 8的活化作用,而激活的Caspase 8可能与抑制自噬增加卵巢癌细胞的顺铂敏感性有关。2、细胞转染p62蛋白UBA和LIR结构域点突变体,抑制了顺铂诱导的卵巢癌细胞Caspas8的活化,增加了细胞自噬流量,提示自噬流量可能会影响p62对Caspase 8的活化作用,其作用机制与UBA和LIR结构域有关。3、通过免疫共沉淀、免疫荧光以及GST-pull Down实验发现在卵巢癌细胞中p62、Caspase 8以及LC3存在共定位。提示自噬体膜可能为p62活化Caspase8提供了“分子平台”,可见自噬流量是决定p62是否活化Caspase 8的主要因素。与原发性高表达的p62不同,抑制自噬导致的p62累积(诱导性)可能通过增加顺铂对Caspase 8的活化发挥了促死亡作用,增加了卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。4、组织芯片结果显示,与p62单独高表达组相比,Caspase 8与p62共同高表达的卵巢癌患者生存期较长、恶性程度与复发风险较低,由此推测Caspase 8可能作为p62的辅助分子,增加对卵巢癌患者预后判断的准确性。综上所述,本研究发现Caspase 8不仅仅能够介导细胞凋亡信号,通过与p62联合分析,Caspase 8还可能间接反映卵巢癌细胞的自噬水平,这些机制的探讨可能有助于阐明抑制自噬增加顺铂等化疗药物敏感性的机制,为卵巢癌临床患者预后以及对化疗药物敏感性的判定提供新的线索。