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自噬是高度保守的真核细胞回收过程,其重要功能之一就是维持细胞稳态,主要通过溶酶体降解老旧的细胞器和错误折叠的蛋白质进行循环更新。因此,自噬功能的障碍可能导致许多疾病的发生发展。早期的研究认为细胞自噬是细胞存活的机制,但越来越多的研究证实,细胞自噬也能控制细胞死亡过程。目前,自噬与众多细胞死亡方式间的关系错综复杂,调节自噬过程已成为当前研究细胞死亡相关疾病的热点。.近年来,灭活的仙台病毒(Hemagglutinating virus of Japan evelope,HVJ-E)因其高效的癌症治疗潜力而被广泛关注。本文以宫颈癌Hela细胞为对象,结合本实验室的前期研究结果,旨在探索自噬在HVJ-E致Hela细胞死亡中的作用机制。HVJ-E作用Hela细胞后,我们观察到细胞形态发生改变,贴壁细胞减少。随后,CCK-8检测发现,经HVJ-E作用后,Hela细胞存活率下降且呈剂量依赖性,提示HVJ-E能诱使Hela细胞死亡。然后,透射电镜观察发现,经HVJ-E作用的Hela细胞出现双层膜的自噬体和单层膜的自噬溶酶体;GFP-LC3质粒转染Hela细胞后,接种HVJ-E的细胞中绿色聚点显著增多,这表明HVJ-E能诱导Hela细胞发生自噬。最后western-blot检测结果显示,在HVJ-E作用下,自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ表达逐渐增强,自噬降解底物蛋白SQSTML/p62表达水平降低,进一步证实了 HVJ-E能诱导Hela细胞发生自噬。自噬调控通路主要包括正调控的Ⅲ型PI3K/Beclinl信号转导途径和负调控的Ⅰ型PI3K/Akt/mTOR通路。Western-blot检测发现,HVJ-E处理Hela细胞能够抑制Akt和mTOR的磷酸化水平,为验证上述发现,我们分别使用740Y-P(PI3K激活剂)和SC79(Akt激动剂)预处理Hela细胞,再接种HVJ-E。结果显示,在740Y-P或SC79存在下,HVJ-E处理Hela细胞6h,下调的Akt或mTOR活性显著恢复。这些结果证实,PI3K/Akt/mTOR途径在HVJ-E诱导Hela细胞自噬中发挥作用。本实验室之前的研究表明,HVJ-E诱导Hela细胞凋亡主要通过激活Erk1/2信号通路,而Erk1/2信号在自噬中也发挥着重要的作用,为进一步阐明Erk1/2在HVJ-E致Hela细胞死亡中的作用,我们以Erk1/2抑制剂预处理细胞,再以HVJ-E作用Hela细胞,结果发现,抑制Erk1/2可以同时抑制自噬和凋亡。为进一步研究HVJ-E致Hela细胞凋亡与自噬间的关系,我们用rapamycin(自噬诱导剂)和CQ(自噬抑制剂)来探讨自噬与凋亡的关系,结果发现,rapamycin能增强HVJ-E诱导的细胞凋亡,反之,抑制自噬能减弱凋亡。