目的:　　皮肤深部组织损伤是临床护理过程中出现的严重医疗事故，现今还未有有效的治疗方法。研究显示，aFGF(Acidic fibroblast growth factor)可以显著改善糖尿病引起的溃疡;但是由于皮肤屏障的存在，aFGF无法对深部组织损伤发挥治疗作用。本项课题的目的是利用表皮完整的大鼠压疮作为模型，研究TAT（Transactivator of transcription protein of HIV）介导aFGF在皮肤屏障的穿膜效应，并考察TAT-rhaFGF融合蛋白对大鼠压疮的治疗效果。同时结合细胞实验深入探讨TAT-rhaFGF融合蛋白发挥作用的分子机制。　　方法:　　1.TAT-rhaFGF融合蛋白的表达、纯化以及鉴定　　通过分子生物学构建质粒载体，将测序鉴定正确的TAT-rhaFGF融合蛋白重组质粒，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，利用100 ug/mL氨苄西林抗性琼脂板筛选出阳性转化子。用IPTG诱导表达重组蛋白，得出最佳的表达条件，同时确定蛋白表达形式。利用肝素亲和层析和离子交换树脂联用，分离纯化TAT-rhaFGF蛋白，将所得到的重组蛋白进行western bloting鉴定。最后用SDS-PAGE和高效液相色谱鉴定蛋白纯度，分装冻存备用。。　　2.TAT-rhaFGF蛋白—凝胶的制备　　为解决给药剂量不准确，蛋白在常温容易失活的缺陷，本试验中将融合蛋白制备成一种温敏凝胶制剂。　　3.TAT-rhaFGF蛋白在健康小鼠背部皮肤的穿膜考察　　将48只Balb/c小鼠麻醉，剔去小鼠背部毛发(3 cm×3 cm)。24 h小时之后将50μl（60μg/ml）aFGF、TAT-rhaFGF、PBS溶液均匀涂抹于小鼠背部皮肤。在不同时间点(0 min，30 min，2h，8h)处死小鼠，并获取小鼠皮肤及皮下肌肉组织，4％多聚甲醛固定。常规石蜡包埋、切片，免疫组织化学检测真皮层内以及皮下组织aFGF的含量。　　4.TAT-rhaFGF改善大鼠压疮溃疡研究　　分别在造模后0天、3天、7天、14天纪录表观形态学变化。取造模处皮肤及皮下肌肉组织，4％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片。利用HE、Masson、Tunel、免疫组织化学染色等病理学手段，结合病理学跟分子生物学探讨损伤部位的修复情况。最后向通过向人皮肤成纤维细胞中加入TNF-α模拟炎症状态，考察人成纤维细胞中α-SMA，TGF-β1 and TGFβRⅡ表达;接着用TAT-rhaFGF进行干预，利用western blot技术进一步探索TAT-rhaFGF发挥作用的分子机制。　　结果:　　1.重组蛋白的表达纯化、western blot鉴定　　经肝素亲和色谱与离子交换色谱纯化后，SDS-PAGE电泳显示TAT-rhaFGF纯度达90％以上。通过Western blot鉴定，所纯化到的蛋白为TAT-rhaFGF融合蛋白。　　2.通过处方优化，制备得到稳定且具有活性的TAT-rhaFGF温敏性凝胶　　成功制备得到稳定的TAT-rhaFGF凝胶。格鲁斯特新药部活性结果为:该TAT-rhaFGF凝胶在4℃的稳定性明显高于溶液状态下的TAT-rhaFGF。在4℃和25℃存放三个月后，凝胶中的TAT-rhaFGF仍然具有活性。　　3.TAT介导rhaFGF穿透小鼠背部皮肤及大鼠皮肤　　结果发现，小鼠背部给予TAT-rhaFGF之后2小时，即可用免疫组化的方法在真皮层检测到阳性aFGF信号。在大鼠皮肤中，给药后5h用免疫荧光的手段同样检测到了阳性信号;而aFGF组跟PBS组则均为阴性。　　4.TAT-rhaFGF融合蛋白可以显著改善损伤组织修复　　较aFGF凝胶与空白凝胶对照组，TAT-rhaFGF融合蛋白给药后可以明显加速创伤的修复。TUNEL结果显示TAT-rhaFGF融合蛋白给药后凋亡指数显著降低。HE与Masson染色结果表明TAT-rhaFGF融合蛋白可以加速创伤的生理性修复。免疫组化结果表明TAT-rhaFGF融合蛋白的可以在创伤修复前期促进皮肤肌肉组织细胞增殖、促进细胞外基质合成，从而加速创伤的修复;在后期则可以下调皮肤中TGF-β1与α-SMA的表达，抑制瘢痕的形成，从而促进皮肤组织的生理性修复。　　结论:　　1.成功表达纯化TAT-rhaFGF融合蛋白。　　2.经过处方优化，所制备的凝胶可以显著改善TAT-rhaFGF融合蛋白在4度时的稳定性，且不影响蛋白的活性。　　3.通过免疫组化考察不同时间点时皮肤组织中aFGF的含量，结果发现:经皮肤给药2h后，TAT-rhaFGF融合蛋白可以有效穿过小鼠皮肤的角质层、表皮。在大鼠模型中，给药后5h，可用免疫荧光的方法检测到皮下组织中有大量aFGF阳性信号。说明TAT可以介导aFGF穿过小鼠和大鼠的皮肤屏障，为后续创伤模型实验奠定了基础。　　4.TAT可以介导aFGF穿透皮肤屏障，并可加速表皮完整型组织损伤的修复。这为将来TAT-rhaFGF的临床应用提供了理论基础。