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第一部分Ref-1在庆大霉素耳毒性损伤及抗氧化治疗豚鼠耳蜗中的表达研究背景越来越多的研究证据表明氨基苷类抗生素耳毒性的产生与内耳自由基氧化损伤有关。自由基的产生与清除失衡，引起内耳氧化还原反应状态改变，导致耳蜗和前庭器官的细胞损害。这一过程涉及许多复杂的细胞死亡途径和调控机制，但这些机制目前尚不清楚。氧化还原状态的改变可触发细胞内调节氧化还原状态的相关信号转导因子的表达及其功能变化，其中氧化还原因子1（Ref-1）在调节细胞氧化还原状态及氧化损伤的自身防护机制中起重要作用。目的研究庆大霉素所致耳毒性损伤及应用抗氧化剂水杨酸钠保护时Ref-1在豚鼠耳蜗中的表达，探讨Ref-1在氨基苷类抗生素耳毒性机制中的作用。方法健康雄性白色红目豚鼠50只，随机分为5组。Ⅰ组（对照组）：腹腔内注射生理盐水，连续7天；Ⅱ组（庆大霉素7日组）：腹腔内注射硫酸庆大霉素，连续7天；Ⅲ组（庆大霉素+水杨酸钠7日组）：腹腔内注射硫酸庆大霉素和水杨酸钠，连续7天；Ⅳ组（庆大霉素14日组）：腹腔内注射硫酸庆大霉素，连续14天；Ⅴ组（庆大霉素+水杨酸钠14日组）：腹腔内注射硫酸庆大霉素和水杨酸钠，连续14天。分别检测听性脑干反应（ABR）阈、耳蜗铺片和毛细胞计数观察毛细胞损失情况，以了解听功能和耳蜗形态学改变；采用石蜡切片Ref-1免疫组织化学染色，图像分析系统进行灰度分析；提取耳蜗组织蛋白，采用Western blot检测各组Ref-1蛋白表达；提取耳蜗组织RNA，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测各组Ref-1mRNA的表达水平，对其成像进行电泳条带光密度测定。结果（1）听功能改变：给药后各组ABR反应阈由高到低依次为：庆大霉素14日组＞庆大霉素+水杨酸钠14日组＞庆大霉素7日组＞庆大霉素+水杨酸钠7日组＞对照组，各组间阈值比较有统计学显著差异（P＜0.05）。（2）耳蜗毛细胞计数：耳蜗基底膜铺片和毛细胞计数显示对照组外毛细胞无明显缺失，各实验组外毛细胞缺失程度从重到轻依次为：庆大霉素14日组＞庆大霉素+水杨酸钠14日组＞庆大霉素7日组＞庆大霉素+水杨酸钠7日组，各组间外毛细胞计数有显著差异（P＜0.05）。（3）耳蜗切片免疫组化：对照组耳蜗螺旋器和螺旋神经节细胞Ref-1呈弱阳性表达，主要表达于细胞浆；庆大霉素7日组耳蜗Ref-1表达增强，并有较多胞核着色的细胞；庆大霉素+水杨酸钠7日组呈强阳性表达，主要表达于细胞核；庆大霉素14日组阳性表达程度较庆大霉素7日组弱，胞核阳性表达细胞数较少；庆大霉素+水杨酸钠14日组阳性表达程度介于庆大霉素7日组和14日组之间。各组灰度值有显著性差异（P＜0.01）。（4）Western Blot检测：内参照β-actin表达稳定。对照组耳蜗Ref-1蛋白有低强度表达；庆大霉素7日组表达明显增强，庆大霉素+水杨酸钠7日组表达最强；庆大霉素14日组表达轻度增强，庆大霉素+水杨酸钠14日组表达介于庆大霉素7日组和14日组之间。各组间蛋白电泳积分光密度值有显著性差异（P＜0.01）。（5）RT-PCR检测：抽提耳蜗组织总RNA电泳结果OD260／280在1.9～2.0之间。对照组耳蜗Ref-1 mRNA有低强度表达；庆大霉素7日组表达强度明显增加，庆大霉素+水杨酸钠7日组表达强度最高；庆大霉素14日组表达轻度增强，庆大霉素+水杨酸钠14日组表达介于庆大霉素7日组和14日组之间。各组mRNA电泳积分的光密度值有显著性差异（P＜0.01）。结论Ref-1在正常豚鼠耳蜗螺旋器和螺旋神经节细胞的胞浆中轻度表达。庆大霉素给药后早期耳蜗中Ref-1蛋白和mRNA表达上调，并在部分细胞自胞浆向胞核内移位。同时给予抗氧化剂水杨酸钠可进一步促使Ref-1由胞浆向核内移位并显著增强其mRNA和蛋白表达。各实验组Ref-1蛋白和mRNA的表达水平与外毛细胞数量及听功能保存程度一致。上述结果提示在庆大霉素导致耳蜗损害的过程中，Ref-1可能在机体的防护机制里起作用。第二部分NF-κB在豚鼠庆大霉素耳毒性损伤和抗氧化剂保护中的作用研究背景核转录因子是一类具有与某些特定基因上启动子区域的固定核苷酸序列结合而启动基因转录功能的蛋白质。有研究提示核因子-κB（NF-κB）参与内耳的氧化应激，保护内耳毛细胞，但关于氧化还原状态改变所致NF-κB激活的机制目前尚不明确。最近研究提示Ref-1蛋白可通过影响NF-κB p50亚基的DNA结合力而调控NF-κB的转录活性。目的研究庆大霉素耳毒性损伤及同时应用抗氧化剂水杨酸钠时NF-κB在豚鼠耳蜗的表达及其DNA结合活性的变化，以探讨NF-κB在氨基苷类抗生素耳毒性机制中的作用及其与Ref-1的关系。方法健康雄性白色豚鼠40只，按本文第一部分的分组法进行分组和处理：Ⅰ组（对照组）、Ⅱ组（庆大霉素7日组）、Ⅲ组（庆大霉素+水杨酸钠7日组）、Ⅳ组（庆大霉素14日组）、Ⅴ组（庆大霉素+水杨酸钠14日组）。每组均行石蜡切片NF-κB p50免疫组织化学染色，通过图像分析系统进行灰度分析；提取耳蜗组织核蛋白，应用电泳迁移率滞后分析（EMSA）检测NF-κB的DNA结合活性，对成像的电泳条带行光密度测定并半定量分析。结果（1）耳蜗切片免疫组化显示，对照组耳蜗NF-κB p50呈弱阳性表达，主要表达于胞浆；庆大霉素7日组耳蜗呈阳性表达，胞核染色细胞数增多；庆大霉素+水杨酸钠7日组表达呈阳性，主要表达于细胞核；庆大霉素14日组阳性表达程度较庆大霉素7日组弱，胞核阳性表达细胞数较少；庆大霉素+水杨酸钠14日组阳性表达程度介于庆大霉素7日组和14日组之间。各组灰度值间有显著统计学差异（P＜0.01）。（2）EMSA探针竞争性反应显示，耳蜗提取的核蛋白存在NF-κB特异性结合带。电泳条带光密度测定结果表明，各组耳蜗组织核蛋白中NF-κB的DNA结合活性强度依次为庆大霉素+水杨酸钠7日组＞庆大霉素7日组＞庆大霉素+水杨酸钠14日组＞庆大霉素14日组＞对照组，各组间积分光密度值比较有显著统计学差异（P＜0.01）。（3）各组NF-κB的表达分布及DNA结合活性变化与其Ref-1蛋白及mRNA表达的改变一致。结论庆大霉素可引起NF-κB自胞浆向胞核转位，其DNA结合活性增加；水杨酸钠可进一步促进NF-κB向胞核移位，显著增加其DNA结合活性。NF-κB表达和DNA结合活性的变化与Ref-1的表达呈一致性。上述结果提示Ref-1和NF-κB两者在庆大霉素所致耳蜗氧化损伤机制中起代偿性防护作用，水杨酸钠的抗氧化防护作用可能与Ref-1表达上调和NF-κB的激活有关。这些结果对于进一步阐明氨基苷类抗生素耳蜗氧化损伤的调控机制具有一定理论意义。