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肝脏承担着代谢与解毒两大主要功能,而在家禽生产过程中病原微生物入侵及其分泌毒素感染是最常见的肝脏损伤诱因。脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,细菌在肠道内溶解后释放的大量LPS由门静脉进入肝脏,对机体的肝脏和脾脏等组织造成损伤,破坏机体免疫系统,进而影响动物的生长性能和免疫功能（Protzer et al.2012;Schnabl and Brenner 2014）。表观遗传修饰在炎症等多种疾病中发挥重要作用,蛋白质精氨酸甲基转移酶家族（protein arginine methyl-transferase,PRMTs）主导的蛋白质精氨酸甲基化就是一种重要的翻译后修饰,作为PRMTs家族中的主要酶PRMT1和PRMT5已被证实参与炎症调控,同时近年来相关研究显示PRMT1和PRMT5在白血病、小细胞肺癌等多种癌症中发挥协同作用,但目前PRMT1和PRMT5在炎症调控方面的协同作用机制仍是未知。肝脏炎症中PRMT1和PRMT5的表达是否发生变化?在肝脏炎症中PRMT1和PRMT5是否存在协同机制?就上述这些问题,本团队开展了本试验的研究工作。试验一:LPS肝脏炎症模型中PRMT1、PRMT5的表达变化。使用15 mg/kg剂量的LPS构建小鼠炎症模型,检测PRMTs家族蛋白表达情况。试验结果显示:LPS模型小鼠肝脏HE染色切片中细胞体积增大疏松且炎性细胞浸润明显增多,同时细胞因子显著升高,肝脏组织中PRMT1和PRMT5的蛋白表达显著下降（P<0.05）。使用1000 ng/m L剂量的LPS构建肝细胞炎症模型,结果显示:LPS刺激下,细胞因子显著升高,且PRMT1和PRMT5蛋白表达显著降低（P<0.01）。本章节成功构建LPS肝脏炎症的在体和离体模型,PRMT1和PRMT5在LPS诱导的肝脏炎症中发生同向性降低。试验二:PRMT1和PRMT5在LPS肝脏炎症中的调控机制。使用10μM NF-κB抑制剂（PDTC）和1000 ng/m L LPS刺激LO2细胞,PDTC-LPS处理组的P-p65蛋白表达显著降低,但PRMT1和PRMT5仍随着LPS刺激而不断下降。LPS炎症模型中,P-STAT1蛋白表达先上升后下降,而P-STAT3蛋白表达持续下降。为探究PRMT1和PRMT5是否作为蛋白质精氨酸甲基转移酶发挥作用,分别使用si-PTMT1、si-PRMT5和PRMTs抑制剂（AMI-1）处理LO2细胞。结果显示:特异性敲低PRMT1和PRMT5后P-STAT3的蛋白水平无显著变化;而AMI-1处理组的P-STAT3蛋白表达显著下调（P<0.01）,这与LPS炎症模型中的变化趋势一致;LPS炎症模型中ADMA和SDMA的蛋白表达逐渐降低。本章节证明了LPS诱导的肝脏炎症中NF-κB、JAK-STAT1和JAK-STAT3信号通路被激活,同时也证明了LPS诱导的肝脏炎症中PRMT1和PRMT5作为蛋白质精氨酸甲基转移酶发挥调控作用。试验三:PRMT1和PRMT5的协同作用机制。利用PRMTⅠ型、PRMT5抑制剂刺激LO2细胞,结果显示:LPS组细胞明显变小、变形、变少,联合抑制剂组细胞出现相同变化,单一抑制剂组无明显变化;细胞因子检测结果显示LPS处理组显著升高（P<0.001）,单一抑制剂组无变化,联合抑制剂组也显著升高（P<0.001）;ADMA和SDMA的蛋白检测结果显示:PRMT I型抑制剂下ADMA显著降低,SDMA代偿性升高,而PRMT5抑制剂下SDMA显著降低,ADMA代偿性升高,只有联合抑制剂组ADMA和SDMA同时下降,这些结果证明PRMT1和PRMT5之间存在代偿机制;同时本章节利用Co-IP（免疫共沉淀）技术验证了LO2细胞内源性PRMT1和PRMT5的相互结合作用。根据PRMTs甲基化底物氨基酸序列富含RG/RGG基序的特性,从数据库中筛选出PRMT1和PRMT5的候选共同底物12个,利用IP（免疫沉淀）和银染技术确定底物蛋白的分子量范围。将候选底物表达质粒转入LO2细胞并进行PRMTⅠ型、PRMT5抑制剂刺激,Co-IP结果显示:hnRNPK组的免疫共沉淀产物中存在代偿机制,即hnRNPK是PRMT1和PRMT5的共同底物。为确定甲基化底物位点,根据hnRNPK的RG、RGG位置构建精氨酸点突变质粒9个,再次进行上述处理,Co-IP结果显示:hnRNPK-232RK（第232位精氨酸点突变为赖氨酸）处理组不再存在代偿机制,即hnRNPK第232位精氨酸是PRMT1和PRMT5共同甲基化位点。试验四:hnRNPK通过精氨酸甲基化修饰调控细胞增殖。本章节将Flag-pc3.1、Flag-hnRNPK、Flag-hnRNPK-232RK三种质粒转染到LO2细胞内,48 h后收集细胞样用以检测细胞活力及细胞增殖、凋亡标志性基因的表达情况。结果显示:点突变组p53的m RNA表达显著下降（P<0.05）和hnRNPK组c-Myc的m RNA表达显著降低（P<0.05）,同时CCK8细胞活力检测结果与RT-q PCR结果一致,因此hnRNPK甲基化修饰会促进细胞的凋亡。综上所述,本研究发现了LPS诱导的肝脏炎症中PRMT1和PRMT5的协同作用机制。在LPS诱导的肝脏炎症中PRMT1和PRMT5同向性下调,激活了NF-κB、JAK-STAT1和JAK-STAT3等炎症调控信号通路;同时PRMT1和PRMT5的降低也抑制了PRMT1和PRMT5对底物蛋白hnRNPK第232位精氨酸的甲基化修饰,hnRNPK甲基化缺失抑制了p53的转录活性并增强了c-Myc转录活性,从而促进肝细胞的增殖。这些结果丰富了不同类型蛋白质精氨酸甲基转移酶之间的协同作用方式,为畜牧生产过程中常见的细菌感染性疾病治疗和动物肝损伤防治提供理论基础。