背景和目的:经皮冠状动脉血管成形术已成为近三十年来心脏病不可或缺的介入性治疗手段,它致力于使缺血性心脏尤其是急性梗塞的心肌获得再灌注。它的使用几乎可以使所有受累冠状动脉恢复血流,但是却可能使心肌出现再灌注不良,这被称为无复流（no-reflow,NR）现象。NR可以抵消或者至少部分抵消该介入治疗带来的良好效应,是心源性猝死的独立预测因子。它的发生机制主要为微循环障碍,与白细胞的聚集和黏附有关,内皮细胞的损伤及功能改变在其中起着重要作用。焦亡是一种伴随炎性反应的新型细胞程序性死亡方式,参与包括动脉粥样硬化、糖尿病性心脏病和心肌梗死等多种心血管疾病的病理进程,但它是否参与心肌NR未见报道。硫化氢（hydrogen sulfide,H₂S）是继一氧化碳和一氧化氮之后的第三种气体信号分子,具有抑制炎症、舒张血管和抗氧化应激等效应。本实验室前期研究发现外源性H₂S能限制大鼠缺血-再灌注（ischemia-reperfusion,I/R）后的心肌梗死面积,具有心肌保护作用,但是否通过抑制焦亡来实现尚未见报道。因此,本实验的研究目的是探讨H₂S是否能减轻心肌NR,并进一步探究其保护作用是否与影响内皮细胞焦亡有关,为临床上预防和治疗NR提供新的思路及方法。第一部分:H₂对大鼠心肌无复流的影响及研究【目的】观察H₂对大鼠心肌NR的影响及其机制是否与焦亡有关。【方法】在成功建立大鼠心肌NR模型的基础上,将18只SD雄性大鼠随机分为5组:假手术组:冠状动脉左前降支（left anterior descending,LAD）处仅穿线不结扎;NR组:LAD处结扎使心肌缺血1h,松结复灌3h;H₂+NR组:Na HS（40μmol/L,ip）+NR;PPG+NR组:PPG（50mg/kg,ip）+NR;PPG+H₂+NR组。采用改良亚甲基蓝法检测大鼠血浆中的H₂浓度;采用伊文思蓝染色检测心肌缺血区域,硫黄素S染色检测心肌NR区域,心电图ST段回降率判断心肌NR的情况,心肌组织切片H/E染色检测炎性细胞的浸润和心肌损伤程度;采用Western blot检测心肌组织中焦亡标志性蛋白的表达水平;采用免疫荧光法检测NR组和H₂+NR组大鼠心肌组织中内皮细胞的焦亡。通过上述实验明确H₂对心肌NR的作用,以及其保护作用是否与减轻内皮细胞焦亡有关。【结果】血浆H₂含量显示,与NR组相比,H₂+NR组大鼠的血浆H₂含量明显增高（P<0.01）,而PPG+NR组的H₂含量则降低（P<0.05）。PPG+H₂+NR组大鼠的血浆H₂含量则高于PPG+NR组（P<0.05）;硫黄素S染色显示,与NR组相比,H₂+NR组大鼠心肌的NR面积明显减小（P<0.05）,ST段回降率显著增高（P<0.01）,心肌炎性细胞的浸润和损伤程度均减轻,PPG+NR组反之;与NR组相比,H₂+NR组大鼠NR心肌的焦亡标志性蛋白NLRP3（P<0.05）和pro-caspase-1（P<0.01）的表达均降低。pro-caspase-1在PPG+NR组表达增高（P<0.05）,而NLRP3在PPG+NR组虽然有表达增高的趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）。PPG+H₂+NR组大鼠心肌的两种焦亡标志性蛋白的表达相较于PPG+NR组均增高（P<0.05）;免疫荧光显示,H₂+NR组大鼠的血管内皮细胞焦亡程度较NR组减轻。【结论】H₂能减轻大鼠心肌无复流,其保护作用与减轻焦亡有关。第二部分:H₂对缺氧-复氧诱导的内皮细胞焦亡的影响【目的】观察H₂对缺氧-复氧诱导的内皮细胞焦亡的影响,从依赖于caspase-1激活的焦亡经典途径探讨其作用机制。【方法】在成功建立内皮细胞H/R模型的基础上,首先为明确H₂对内皮细胞H/R的影响,将内皮细胞分为8组:H/R组;12.5μmol/L Na HS+H/R组;25μmol/L Na HS+H/R组;50μmol/L Na HS+H/R组;75μmol/L Na HS+H/R组;100μmol/L Na HS+H/R组;150μmol/L Na HS+H/R组;200μmol/L Na HS+H/R组。通过显微镜观察细胞形态,酶标仪检测细胞培养液中的LDH的活性,以观察不同浓度H₂供体Na HS对细胞H/R损伤的影响。进而为探究H/R是否能诱导内皮细胞焦亡,将内皮细胞分为3组:Control组、Hypoxia组和H/R组。采用Western blot检测pro-caspase-1、ASC、NLRP3、GSDMD和IL-18的蛋白表达水平以及酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测IL-1β的释放。进而为明确H₂是否能抑制H/R诱导的内皮细胞焦亡,将内皮细胞分为4组:H/R组、Na HS+H/R组、PPG+H/R组和Na HS+PPG+H/R组。采用Western blot检测pro-caspase-1、GSDMD、NLRP3、IL-18和ASC的蛋白表达水平。最后为探究H₂对ICAM-1的影响,将内皮细胞分为8组（实验分组同前8组）,采用ELISA法检测内皮细胞ICAM-1的分泌。【结果】（1）LDH活性显示,结果与对照组相比,低浓度H₂（70μmol/L、100μmol/L）能减轻内皮细胞H/R损伤,减少其LDH的释放（P<0.01）。（2）WB显示,与对照组相比,H/R组的NLRP3（P<0.01）、GSDMD（P<0.05）、pro-caspase-1（P<0.01）、ASC（P<0.05）和IL-18（P<0.05）的蛋白表达水平明显增加;ELISA结果显示,H/R组内皮细胞释放的IL-1β较对照组增加（P<0.01）,表明H/R诱导内皮细胞焦亡。（3）与H/R组相比,H₂+H/R组IL-18（P<0.01）、pro-caspase-1（P<0.05）、GSDMD（P<0.05）、NLRP3（P<0.05）和ASC（P<0.05）的蛋白表达均降低。与之相反,PPG+H/R组IL-18（P<0.05）、ASC（P<0.05）和pro-caspase-1（P<0.01）的蛋白表达均增高,而GSDMD和NLRP3虽有增高趋势,但无统计学意义（P>0.05）。相较于PPG+H/R组,PPG+H₂+H/R组pro-caspase-1的蛋白表达显著增高（P<0.01）,其余蛋白的表达也增高（P<0.05）。表明H₂可抑制H/R诱导的内皮细胞焦亡。（4）与对照组相比,低浓度H₂明显减轻内皮细胞H/R后黏附分子ICAM-1的释放（P<0.01）。【结论】H₂抑制H/R诱导的内皮细胞焦亡。