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实验一 七氟醚吸入对小鼠抑郁样行为的影响背景:随着现代社会的发展,抑郁症已成为困扰人类的第一大精神疾病,一项有关中国住院病人抑郁状况的最新调查研究显示,30%的住院患者并存具有临床表现的抑郁情绪,15%有显著的焦虑情绪,并且有6%的病人有反复的自杀意向。由疾病本身引起的心理压力、各种环境因素以及外科手术病人在手术过程中所受到的应激的影响,使得其容易产生焦虑抑郁的情绪,这给患者的预后带来了诸多不利影响,因此需要临床医生更多的关注。目前临床常用的经典抗抑郁药大多疗效缓慢,且许多患者对其反应不佳,对于耐药患者常选择电休克疗法(electroconvulsive therapy,ECT),但重复的ECT治疗会产生认知功能损害的副作用,因此寻找可以缓解焦虑抑郁等情绪以及治疗抑郁症的药物成为亟待解决的问题。氯胺酮是目前被证实有确切抗抑郁疗效的麻醉用药,单次给予氯胺酮即能显著改善患者的抑郁症状,因此对于在临床麻醉中常用的吸入性麻醉药七氟醚,其是否也能改善患者的焦虑抑郁状态值得研究。方法:在检测急性环境下小鼠抑郁样行为的实验中将小鼠分为两组:CON组(吸入流量为2L/min,浓度为30%的氧气30min,n=24)与SEV组(吸入不同浓度的七氟醚30min,n=72),之后将SEV组分为三个亚组(n=24):1.5SEV组(吸入浓度为1.5%的七氟醚30min),2.5SEV组(吸入浓度为2.5%的七氟醚30min)和3.5SEV组(吸入浓度为3.5%的七氟醚30min),吸入结束后再将动物细分为三组分别进行各个行为学实验(n=8),包括吸入结束后即刻在旷场实验装置内进行的持续30min的自发活动能力检测,以及在吸入结束待小鼠完全清醒后采用的强迫游泳实验(Forced swimming test,FST)以及新奇抑制摄食实验(Novelty-suppressed feeding test,NSFT)来进行抑郁相关的行为学检测。采用慢性不可预知温和应激(Chronic unpredictable mild stress,CUMS)模型连续六周给予小鼠温和刺激建立小鼠慢性抑郁模型,模型建立完成后将其分为两组(n=32):CUMS组(慢性抑郁小鼠吸入30%氧气30min)与CUMS-SEV组(慢性抑郁小鼠吸入2.5%七氟醚30min),同期未进行造模的小鼠为对照组CON组(吸入30%氧气30min,n=32),CON组、CUMS组与CUMS-SEV组在吸入结束后均细分为四组进行行为学检测(n=8),包括吸入结束即刻在旷场装置中进行30min的运动能力的检测,以及在吸入结束后15min进行的抑郁相关行为学检测,包括旷场实验(Open Field Test,OFT),强迫游泳实验以及新奇抑制摄食实验。结果:检测急性应激环境下小鼠抑郁样行为的实验中,运动能力检测结果表明,与CON组相比,1.5SEV组与2.5SEV组在吸入结束15min后自发活动能力恢复,而3.5SEV组在吸入结束20min后自发活动能力恢复。因此在后期行为学实验中,1.5SEV组与2.5SEV组选用吸醚结束后15min作为时间点进行行为学检测,3.5SEV组选用吸醚结束后20min作为时间点进行行为学检测。2.5 SEV组小鼠在急性应激环境下抑郁样行为减少,表现为在FST中不动时间显著减少以及在NSFT中摄食潜伏期缩短,而1.5SEV组与3.5SEV组小鼠在行为学检测中未表现出抑郁样行为的减少,所以选用2.5%七氟醚浓度进行后续实验。在CUMS慢性抑郁模型小鼠中,首先对吸入结束后小鼠的运动能力进行检测,与CUMS组相比,CUMS-SEV组小鼠在吸入七氟醚结束后15min自发活动能力恢复。在与抑郁相关的行为学检测中,与CON组相比,CUMS组的抑郁样行为明显增多,表现为在OFT中进入中央区时间减少和粪便颗粒数增加,以及在FST中的不动时间和在NSFT中的摄食潜伏期均显著增加;与CUMS组相比,CUMS-SEV组在OFT中进入中央区的时间增加以及粪便颗粒数减少,在FST中的不动时间减少以及在NSFT中的摄食潜伏期显著缩短。结论:研究结果显示,由多项行为学结果证实,七氟醚对于小鼠在急性应激环境下的抑郁样行为以及长期慢性抑郁样行为均有改善作用。实验二七氟醚通过BDNF-TrkB通路发挥抗抑郁作用背景:经典抗抑郁药物主要作用靶点是调节大脑内不同神经递质的水平,通过提高单胺类神经递质水平改善抑郁症症状。麻醉药物氯胺酮作为NMDA受体拮抗剂,其抗抑郁作用主要依赖于BDNF-TrkB-mTOR信号通路的激活,通过增加脑源性神经营养因子(Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF)的水平发挥快速抗抑郁作用,TrkB作为BDNF的配体,抗抑郁药物通过调节细胞膜上受体的表达介导抗抑郁作用的产生。同时据研究报道,异氟醚能够显著改善习得性无助模型小鼠的抑郁样行为,其作用机制为快速增加TrkB的磷酸化水平。所以我们推测,七氟醚发挥抗抑郁作用的机制同样也涉及BDNF-TrkB信号通路的改变。方法:将检测急性应激环境下抑郁样行为的小鼠分为两组(n=3):CON组(吸入30%氧气30min)与SEV组(吸入2.5%七氟醚30min);进行CUMS模型制备的小鼠分为两组(n=3),CUMS组(CUMS模型小鼠吸入30%氧气30min)与CUMS-SEV组(CUMS模型小鼠吸入2.5%七氟醚30min),CON组为同期未进行CUMS造模,吸入30%氧气30min的小鼠。各组均在吸入结束的即刻进行取材,取小鼠海马(Hippocampus,HC)及大脑前额叶皮层(Prefrontal cortex,PFC)两个部位进行 Western Blot分子生物学检测,测定各组中HC与PFC部位BDNF-TrkB蛋白通路上相关蛋白的改变。结果:Western Blot结果证实,与CON组小鼠相比,2.5SEV组小鼠HC与PFC部位的p-TrkB水平显著增加,但BDNF的含量未见明显变化;经CUMS造模的慢性抑郁模型小鼠中,与CUMS组相比,CUMS-SEV组HC与PFC部位的pTrkB的水平也显著增加,但BDNF的含量没有明显变化。结论:对于处于应激环境下的小鼠与长期慢性抑郁模型小鼠,七氟醚发挥抗抑郁作用的机制是通过BDNF-TrkB信号转导通路介导的,通过诱导BDNF配体TrkB的磷酸化水平的升高发挥抗抑郁的作用,但这种作用并不依赖于BDNF水平的变化。实验三下调总TrkB蛋白对七氟醚抗抑郁作用的影响背景:由以上两部分研究我们得知,七氟醚吸入对处于急性应激环境中的小鼠以及CUMS模型小鼠的抑郁样行为均有改善作用,并且是通过增加BDNF-TrkB信号通路中pTrkB的水平来发挥的,pTrkB作为TrkB的活性形式,是包括速效抗抑郁药氯胺酮以及吸入性麻醉药异氟醚在内的抗抑郁药产生抗抑郁的行为效应所必需的,因此在本部分实验研究中我们将探讨下调总TrkB蛋白后七氟醚抗抑郁作用的变化。方法:侧脑室注射分为四组(n=24):siRNA组(侧脑室注射siRNA149并且吸入30%氧气30min),siRNA-SEV组(侧脑室注射siRNA149并且吸入2.5%七氟醚30min),CON组(侧脑室注射阴性对照siRNA并且吸入30%氧气30min)以及CON-SEV组(侧脑室注射阴性对照siRNA并且吸入2.5%七氟醚30min)。在侧脑室注射完成后72h吸入30%氧气或2.5%七氟醚30min,之后再将各组细分为三组进行各项行为学实验(n=8),包括吸入结束即刻进行的持续30min的旷场实验装置中活动能力的检测以及吸入结束15min后进行的抑郁相关行为学检测FST和NSFT,探讨下调总TrkB蛋白后七氟醚抗抑郁作用的变化。结果:与CON相比,siRNA组小鼠在FST中不动时间显著减少,在NSFT中摄食潜伏期显著缩短;而与siRNA组小鼠相比,siRNA-SEV组小鼠在FST中的不动时间与在NSFT中的摄食潜伏期均显著延长。结论:下调总TrkB蛋白后,吸入七氟醚后其抗抑郁的作用消失,这表明七氟醚的抗抑郁作用与BDNF-TrkB蛋白通路有关。但是下调总TrkB蛋白的小鼠在吸入30%氧气后表现出抑郁样行为的减少,这表明TrkB蛋白本身在抑郁症的发病机制中发挥作用