论文部分内容阅读
旋毛虫病是一种食源性人兽共患寄生虫病,在全球范围内广泛分布,对公共卫生安全造成巨大威胁。研究旋毛虫侵入相关蛋白与宿主互作机制,对于筛选抗旋毛虫药物和研制疫苗具有重要指导意义。天冬氨酸蛋白酶(aspartic proteases,ASPs)是多种寄生性蠕虫的毒力因子,在虫体侵入宿主、发育、免疫逃避中具有重要的作用。然而,ASPs在旋毛虫侵入宿主过程中所发挥的功能尚不明确。本研究选取了旋毛虫中两种具有天冬氨酸蛋白酶结构域的虫体蛋白(TsASP1和TsASP2),克隆表达获得重组蛋白rTsASP1和rTsASP2;分析了 2种旋毛虫蛋白的生物学特性及酶活性;将rTsASP1和rTsASP2分别免疫小鼠,分析2种蛋白抗旋毛虫感染的免疫保护作用;应用RNAi技术研究2种蛋白在旋毛虫侵入宿主小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs)中的功能。本研究结果有助于阐明旋毛虫ASPs的生物学特性及在虫体侵入宿主IECs中的作用,可为研制相应的抗旋毛虫疫苗及药物提供理论基础。材料与方法1.寄生虫、实验动物、细胞系旋毛虫(ISS534)在本实验室经小鼠传代保存;BALB/c小鼠购自河南省实验动物中心;小鼠IECs从胎鼠中分离获得;小鼠成肌细胞(C2C12)系本实验室保存。所有动物实验经郑州大学实验动物伦理委员会同意。2.TsASP1和TsASP2的基因克隆、原核表达和特性分析根据旋毛虫的全基因组信息选定两种天冬氨酸蛋白酶(TsASP1和TsASP2),通过软件及在线工具对两个蛋白进行生物信息学分析。应用RT-PCR从旋毛虫肌幼虫中扩增出TsASP1/TsASP2基因,借助不同表达载体(pQE-80L和pMAL-c2x)原核表达并纯化获得带有His标签和MBP标签的重组蛋白,利用含His标签的重组蛋白免疫小鼠后获得多克隆血清。通过RT-PCR、Real-time PCR、Western-blot及免疫荧光对TsASP1和TsASP2在旋毛虫不同发育时期的基因转录、蛋白表达水平及定位情况进行分析。3.rTsASP1和rTsASP2的酶活鉴定及免疫保护作用分析以血红蛋白及特异性荧光肽段为底物,检测rTsASP1及rTsASP2的蛋白水解活性。通过SDS-PAGE进一步分析具有蛋白水解活性的rTsASP2对其他天然蛋白(血清白蛋白、IgG、IgM、纤维蛋白原及胶原IV)的水解情况;分析rTsASP2抗血清和pepstatin A对rTsASP2水解活性的抑制情况;分析rTsASP2水解特异性底物的酶动力学及其在不同温度、pH及抑制剂环境下的酶催化特征。将rTsASP1及rTsASP2经皮下免疫小鼠,并设置PBS、MBP及佐剂对照组。应用ELISA对免疫后小鼠血清抗体(IgG、IgG1、IgG2a)、肠道IgA、脾脏和肠系膜淋巴结(MLN)细胞的细胞因子IFN-γ和IL-4进行检测。在免疫程序结束后对小鼠进行旋毛虫攻击感染,感染后6天和35天分别计算成虫和肌幼虫虫荷及雌虫生殖力,分析免疫后小鼠产生的免疫保护类型及免疫保护效率。4.RNAi沉默TsASP1和TsASP2方法的建立设计特异性TsASP1 siRNA、TsASP2 siRNA、Control siRNA,经电穿孔导入旋毛虫肌幼虫体内。通过显微镜观察带有荧光标记的siRNA导入虫体的情况。通过对RNAi作用后各组虫体中TsASP1和TsASP2的基因转录及蛋白表达水平的检测,分析RNAi基因沉默效果。以TsASP1 siRNA及TsASP2 siRNA互为对照,确定RNAi作用的靶特异性,建立RNAi沉默TsASP1和TsASP2的方法。5.RNAi沉默TsASP1和TsASP2基因的虫体对入侵IECs的影响通过Far-western blot、ELISA、激光共聚焦分析rTsASP1和rTsASP2与IECs间的相互结合作用;分析RNAi作用后虫体中TsASP1和TsASP2与IECs间结合效率的变化情况。建立体外虫体侵入IECs单层细胞模型,分析两种蛋白及相应抗血清对虫体侵入IECs的影响;检测RNAi作用后虫体对IECs单层细胞的侵入效率和损伤的变化情况,确定两种蛋白在虫体侵入IECs中的功能。将不同siRNA及PBS处理过的虫体经口感染小鼠:对各组小鼠的十二指肠切片进行PAS和HE染色,观察虫体侵入宿主后引起肠道病理变化;对回收的6 d成虫和35 d肌幼虫虫荷及6 d雌成虫生殖力进行分析;对不同虫期的虫体长度进行观察并测量;通过扫描电镜观察6 d成虫虫体表面形态。分析RNAi对虫体发育的影响及TsASP1和TsASP2在虫体侵入宿主过程中发挥的功能。6.统计学分析应用SPSS19.0软件对实验数据进行处理,采用的方法主要有单因素方差分析、卡方检验、线性回归等。P<0.05即为数据统计学差异。结果1.TsASP1和TsASP2的基因克隆、原核表达及鉴定生物信息学分析表明,TsASP1和TsASP2都有信号肽、无跨膜区,属于天冬氨酸蛋白酶超家族,且具有双叶型的肽链折叠结构。TsASP2具有天冬氨酸蛋白酶经典活性位点序列Asp-Thr(Ser)-Gly,位于双叶活化中心,而TsASP1的活性位点与经典序列有一些不同。通过克隆及表达成功获得重组蛋白。rTsASP1的分子量为43 kDa(His标签)、86 kDa(MBP 标签);rTsASP2 的分子量为 42.9 kDa(His 标签)、85.9 kDa(MBP 标签),与预测一致。TsASP1和TsASP2基因在肌幼虫(ML)、感染性幼虫(IIL)、成虫(AW)和新生幼虫(NBL)阶段均有转录,其中IIL时期转录水平最高,NBL时期转录水平最低。两种蛋白在ML、IIL、AW及ML的排泄分泌抗原(ES)中被相应抗血清所识别,但在NBL中不能被识别。免疫荧光结果表明:TsASP1主要位于虫体的肌肉细胞、杆状体、雌成虫子宫内胚胎周围;TsASP2主要位于ML和IIL虫体的肌肉细胞、中肠和后肠、雌成虫子宫内胚胎周围。2.TsASP1和TsASP2的酶活性分析及免疫保护作用蛋白水解活性检测表明,rTsASP 1不能水解血红蛋白(Hemoglobin,Hb),rTsASP2能在酸性条件下水解人、鼠和牛Hb,但不水解鸡Hb。rTsASP2水解小鼠Hb的最佳pH值为2.5,水解人和牛Hb最佳pH值为4.5,且水解鼠Hb的效率高于人和牛Hb。rTsASP2亦能水解胶原IV和人IgM。以特异性肽段为底物,测得rTsASP2在pH 2.0至6.0间均有活性,在pH 3.0、温度37℃时相对酶活最高。Pepstatin A可显著抑制rTsASP2酶活。此外,Cu2+、Fe2+可抑制酶活,Mg2+则对酶活有增强作用。通过米氏方程确定 rTsASP2 酶反应动力学:Vmax＝16.68±0.3465 nM/min,Km＝2.254±0.1878 nM。将rTsASP1和rTsASP2分别免疫小鼠:血清中特异性IgG水平显著增高,IgG1的表达水平高于IgG2a;肠道中总IgA及特异性IgA水平增高,表明蛋白免疫后诱导宿主产生了肠道粘膜免疫;脾脏和MLN细胞产生的IFN-γ和IL-4水平均升高,表明宿主产生了 Th1/Th2混合型免疫作用。免疫后对小鼠攻击感染300条旋毛虫:TsASP1和TsASP2免疫组的6 d成虫虫荷减虫率分别为49.79%(P<0.05)和54.18%(P<0.05);TsASP1和TsASP2免疫组的35 d肌幼虫虫荷减虫率分别为50.55%(P<0.05)和54.59%(P<0.05),表明免疫小鼠后对旋毛虫感染产生了免疫保护作用。3.RNAi沉默TsASP1和TsASP2方法的成功建立荧光显微镜观察结果表明,siRNA成功被导入虫体。不同siRNA或PBS处理组的虫体在培养1 d或7d后死亡率无显著差异(P<0.05),表明电转siRNA对虫体死亡率无影响。TsASP1或TsASP2 siRNA处理虫体1d后,即产生有效沉默效果,在第5 d效果最为显著:TsASP1转录水平和蛋白表达水平分别降低66.52%(P<0.05)、63.60%(P<0.05);TsASP2转录水平和蛋白表达水平分别降低58.69%(P<0.05)、64.86%(P<0.05)。Control siRNA处理对TsASP1和TsASP2的基因转录及蛋白表达无明显影响。特异性分析显示TsASP1 siRNA及TsASP2 siRNA具有靶特异性。以上结果表明本研究通过RNAi对TsASP1及TsASP2沉默成功。4.RNAi沉默TsASP1和TsASP2对虫体发育及侵入IECs的影响分析TsASP1 siRNA处理组的虫体天冬氨酸蛋白酶活性为对照组的93.1%(P>0.05);TsASP2 siRNA处理组为对照组的43.3%(P<0.05)。该结果证明TsASP2对虫体天冬氨酸蛋白酶活性有贡献,而TsASP1无天冬氨酸蛋白酶活性。rTsASP1和rTsASP2都能够结合IECs蛋白,且具有剂量依赖性。两种蛋白与IECs结合位置存在差异:rTsASP1结合在IECs的细胞质中;rTsASP2结合在IECs的细胞膜及部分胞质中。同时,两种蛋白免疫血清可以检测到虫体可溶蛋白中天然TsASP1和TsASP2与IECs存在结合,但经RNAi沉默后,这种结合能力显著降低。体外侵入实验显示:rTsASP1与rTsASP2均可促进虫体侵入IECs单层细胞;对应的免疫血清可抑制虫体侵入IECs细胞单层。RNAi作用后,虫体对IECs的侵入率显著降低:其中TsASP1 siRNA组侵入率降低29.45%(P<0.05);TsASP2 siRNA组侵入率降低35.22%(P<0.05)。分析体外侵入实验后IECs细胞单层损伤情况,TsASP1 siRNA和TsASP2 siRNA处理组细胞损伤数量分别降低42.92%(P<0.05)和66.24%(P<0.05)。上述结果揭示两种蛋白在虫体侵入IECs单层细胞中发挥重要功能。Control siRNA组小鼠肠道切片呈现小肠上皮细胞水肿、结构损伤、杯状细胞增多等病理变化,而TsASP1和TsASP2基因沉默组病理变化不明显,且6 d成虫、35 d肌幼虫虫荷及NBL产出量较对照组均显著下降;TsASP1 siRNA组的雌成虫和雄虫长度分别减少16.37%(P<0.05)和11.92%(P<0.05);TsASP2 siRNA组的雌成虫和雄虫长度分别减少20.46%(P<0.05)和24.65%(P<0.05)。扫描电镜显示Control siRNA组的6 d成虫表皮较为光滑,TsASP1和TsASP2基因沉默组的6 d成虫表皮出现一定的皱褶。以上结果表明这两种蛋白在虫体侵入宿主及虫体发育过程中发挥重要功能。结论1.通过原核表达系统成功获得重组蛋白rTsASP1和rTsASP2。TsASP1和TsASP2在旋毛虫不同发育虫期均有转录,在IIL时期转录水平最高,NBL时期转录水平最低且未检测到这2种蛋白的表达。前者主要定位于虫体切片的肌细胞、杆状体、雌虫子宫内胚胎周围,而后者主要定位于肌细胞、中肠和后肠、雌虫子宫内胚胎周围。2.rTsASP2具有天冬氨酸蛋白酶活性,rTsASP1无酶活性。两种蛋白免疫小鼠后均可诱导Th1/Th2混合型免疫反应和抗旋毛虫感染的免疫保护作用,其中rTsASP2产生的免疫保护效果相对更好。3.TsASP1和TsASP2均能结合IECs并促进虫体侵入IECs;RNAi沉默后,虫体中TsASP1和TsASP2表达量显著降低,虫体对宿主IECs的侵入和虫体发育受到抑制。4.TsASP1和TsASP2均是旋毛虫侵入宿主相关蛋白,且两种蛋白均可作为抗旋毛虫疫苗的候选抗原分子。