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研究背景：银屑病(Psoriasis)是一种常见的慢性炎症性皮肤病,病情顽固,且发病率在逐年增高。该病组织病理改变主要为表皮角质形成细胞(keratinocyte, KC)过度增殖和分化异常,真皮乳头毛细血管增生、扩张,以及真表皮内炎症细胞浸润。近年来,银屑病发病的免疫机制备受关注,对银屑病患者皮损处T细胞的特性及其产生细胞因子功能的研究发现,一种新的调节性T细胞即Th17细胞及其活化后产生的细胞因子Interleukin-17A(IL-17A)、 IL-17F和IL-22在银屑病的发病中具有重要作用。一个重要发现是在银屑病患者的皮损及血浆中IL-22表达均显著增加。研究表明,IL-22阻碍KC的终末分化,诱导KC的促炎基因表达和KC的迁移。然而目前并不十分明确IL-22介导的KC效应的细胞分子机制。Grb2-相关结合蛋白1/2(Grb2-associated binder1/2, Gab1/2)是一类脚手架／接头蛋白,主要参与膜表面受体酪氨酸激酶和非受体酪氨酸激酶的信号转导。磷酸化的Gab1通过与含有2个Src同源结构域(SH2)的蛋白酪氨酸磷酸酶(Src homology2domain-containing tyrosine phosphatase,Shp-2)相互作用,具有调节表皮细胞生长因子诱导的表皮生长和分化,但尚不清楚Gab1以及同样高表达于KC细胞上的Gab2在IL-22诱导的KC增殖、迁移和分化中是否发挥作用?银屑病属于中医“白疙”、“蛇虱”、“松皮癣”等范畴。清热解毒,凉血活血是中医治疗本病的重要治则。紫草味甘、咸,性寒,有凉血、活血、清热、解毒透疹等功效。紫草素(Shikonin)为紫草中的主要有效成分之一,具有多种药用价值,包括抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、镇静、清热解毒、免疫调节以及促进伤口愈合等。在对紫草素诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究中发现,紫草素可调节促分裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-ativated protein kinase kinase, MAPK)通路的活性,降低Erk, Jnk, Stat3磷酸化水平,从而抑制肿瘤细胞生长、增殖、存活。临床发现紫草素治疗银屑病具有较好的疗效,但其机制尚有待探讨。我们提出一假设,即紫草素通过拮抗IL-22刺激皮肤角质形成细胞引起的Gab1/2的磷酸化,进一步抑制其下游Erk/MAPK信号通路的活化,从而抑制KC增殖,影响KC分化及迁移等。本文的研究目的：第一部分：研究紫草素对IL-22刺激HaCaT细胞生物学行为影响1.观察紫草素对IL-22刺激HaCaT细胞增殖、迁移的影响;2.观察紫草素对IL-22刺激HaCaT细胞分泌S100A7, S100A8、S100A9的影响。第二部分：紫草素对IL-22刺激HaCaT细胞生物学行为改变的机制研究1.研究IL-22刺激HaCaT细胞中Jak1/Tyk2/Stat, Erk/MAPK信号通路中相关蛋白表达；2.研究IL-22刺激Gab1和Gab2突变体(Shp2结合缺陷型)感染的HaCaT细胞中Erk/MAPK信号通路中相关蛋白表达；3.研究IL-22刺激Gab1和Gab2基因沉默的HaCaT细胞中Erk/MAPK信号通路中相关蛋白表达；4.探讨Gab1和Gab2是否共同参与IL-22诱导的细胞增殖和迁移以及对细胞分化的影响；5.研究IL-22刺激HaCaT细胞后Gab1、Gab2以及Erkl/2磷酸化水平及紫草素干预后的变化。研究方法：1.WST-1法检测细胞增殖；2. Transwell法检测细胞迁移；3. Real-TimePCR法检测基因mRNA表达；4. Western blot法检测相关蛋白的表达；5.免疫沉淀技术检测特定蛋白间的相互作用：6.构建Shp2结合缺陷型Gabl和／或Gab2以及Gabl和Gab2siRNA干扰的重组腺病毒；7.统计学分析：采用SPSS17.0统计软件进行数据分析,P<0.05时差异有统计学意义。研究结果：1.紫草素抑制HaCaT细胞的生长不同浓度的紫草素对HaCaT细胞的生长有一定的抑制作用,但低浓度时(浓度为0.1和0.25μg/ml),紫草素本身不影响细胞活性,对HaCaT细胞无损伤及毒性作用。2.紫草素抑制IL-22介导的HaCaT细胞增殖和迁移实验分组：未处理(未加紫草素和IL-22)组、IL-22刺激24h组、IL-22+紫草素24h组, IL-22刺激48h组、IL-22+紫草素48h组。紫草素作用浓度选择为0.25μg/ml, IL-22推荐工作浓度为100ng/ml, IL-22刺激HaCaT细胞24h和48h后可促进细胞增殖和迁移,与未处理组相比,P均<0.05；加入紫草素组,IL-22诱导的HaCaT细胞增殖和迁移作用被抑制,P均<0.05。3.紫草素可下调IL-22诱导的促炎症因子S100A7、S100A8mRNA表达Real-Time PCR检测紫草素对IL-22刺激HaCaT细胞分泌促炎症因子S100A7、 S100A8、S100A9mRNA影响,根据扩增曲线由公式得出2-△Ct值(即实验组目的基因的表达相对于对照组基因的变化倍数),IL-22刺激S100A7S100A8mRNA表达与未处理组相比其差别倍数(2-△△Ct)均大于2,而加入紫草素组与IL-22组相比其差别倍数均小于1,表明IL-22可明显刺激HaCaT细胞分泌S100A7, S100A8,而紫草素可下调IL-22诱导的S100A7S100A8mRNA表达,但对S100A9mRNA的影响不明显。4.IL-22诱导HaCaT细胞Jak1/Tyk2/Stat通路、MAPK通路的活化HaCaT细胞饥饿处理16-18h后,加入IL-22(100ng/ml)刺激10min、20min、30min、60min以及120min,提取总蛋白,Western blot检测到IL-22刺激10min后即可见Jakl/Tyk2/Stat通路中Stat3Tyr705位酪氨酸磷酸化、Stat3Ser727位丝氨酸磷酸化、Jakl以及Tyk2磷酸化；MAPK通路中Erk1/2和p38磷酸化。Mek抑制剂PD98059(10μM)预处理HaCaT细胞1h,然后再用IL-22刺激,则Erk1/2活化被抑制,同时PD98059预处理后IL-22诱导的HaCaT细胞的增殖及迁移亦被抑制(P分别<0.01和<0.05),而KC细胞分化标志性蛋白Loricrin在IL-22刺激72h后仍未检测到表达,但PD98059预处理后再用IL-22刺激则Loricrin表达明显增加。5.IL-22刺激HaCaT细胞引起Gab1和Gab2磷酸化,并进一步活化Erk1/2IL-22刺激饥饿处理后的HaCaT细胞,10min后裂解细胞,采用免疫共沉淀技术及免疫印迹技术检测IL-22刺激后,Gab1和Gab2磷酸化水平明显升高,Shp2结合增强。以表达Shp2结合缺陷型Gab1和Gab2重组腺病毒(AdGab1FF、AdGab2F)以及野生型Gab1和Gab重组腺病毒(AdGab1WT、AdGab2WT)感染HaCaT,检测IL-22刺激引起的Erkl/2以及Stat3Tyr795蛋白活化水平,结果发现,Erkl/2磷酸化水平在(AdGab1FF)HaCaT、(AdGab2F)HaCaT组明显降低,Stat3Tyr795磷酸化水平在缺陷型组及野生型组基本没有变化；IL-22刺激siRNA沉默Gab1和／或Gab2腺病毒感染的HaCaT细胞(AdGab1siRNA) HaCaT、(AdGab2siRNA) HaCaT、(AdGab1siRNA+AdGab2siRNA) HaCaT,检测Erkl/2以及Stat3Tyr795蛋白活化水平,结果发现,Erkl/2磷酸化水平在基因沉默组中明显降低,磷酸化Stat3Tyr795水平依然没有变化。6.Gab1和Gab2影响IL-22诱导的HaCaT细胞增殖、细胞迁移及分化与Shp2相关IL-22刺激(AdGab1WT)HaCaT、(AdGab2WT)HaCaT、(AdGab1FF)HaCaT、(AdGab2F)HaCaT,24h和48h后分别检测细胞增殖率及细胞迁移,结果(AdGab1FF)HaCaT、(AdGab2F)HaCaT组细胞增殖率减低(P均<0.01),迁移细胞数减少(P均<0.01)；IL-22刺激(AdGab1siRNA) HaCaT、(AdGab2siRNA) HaCaT、(AdGab1siRNA+AdGab2siRNA) HaCaT,24h和48h后检测细胞增殖率和迁移,与感染空载体HaCaT细胞相比,细胞增殖率减低(P<0.05,P<0.01),细胞迁移数减少(P均<0.05)。IL-22刺激重组腺病毒感染的HaCaT的细胞72h后,检测Loricin蛋白的表达,结果发现,与野生型组相比,基因突变和沉默组细胞Loricin的表达量均明显增加。7.紫草素拮抗IL-22刺激皮肤角质细胞引起的Gab1, Gab2以及Erkl/2的磷酸化IL-22刺激经紫草素(0.25μg/ml)预处理HaCaT细胞,检测Gab1和Gab2以及Erkl/2磷酸化水平,与未经紫草素处理组相比,明显减低。研究结论：1.紫草素能够抑制IL-22诱导的HaCaT细胞的增殖和迁移,并下调IL-22诱导的HaCaT细胞S100A7, S100A8mRNA表达。2.IL-22诱导Jak1/Tyk2/Stat及MAPK通路在HaCaT细胞中的活化,介导细胞增殖、迁移和分化。3.Gab1和Gab2共同参与IL-22诱导的HaCaT细胞中的Erk/MAPK信号通路的活化,并共同参与IL-22介导的细胞增殖、迁移和分化。Shp2与Gab1和Gab2结合是IL-22介导的效应所必需的。4.紫草素抑制IL-22诱导的Gabl,Gab2以及Erkl/2磷酸化,从而推论紫草素治疗银屑病机制可能与抑制IL-22引起的Gab1、Gab2磷酸化,进一步抑制Erk1/2-MAPK通路活化有关。