目的促甲状腺激素(thyroid-stimulating hormone, TSH)是调控甲状腺功能的关键蛋白,TSH由α亚基和p亚基通过非共价键连接组成,p亚基具有激素特异性。2009年Vincent等报道了第一个功能性TSHβ剪接变体,TSHβ新剪接变体在免疫—神经内分泌网络中可能具有不同于天然型TSHβ的调控作用。由于该TSHβ剪接变体是新近才被发现的,所以目前对其基本生物学特性、表达调控机制及与甲状腺相关疾病相关性等均不清楚。本研究拟从上述几个方面对这个TSHβ新剪接变体进行逐步深入的探讨。方法1. TSHβ剪接变体在正常人外周血中的研究：对血清样品进行盐析、透析和浓缩预处理后采用免疫沉淀法鉴定人血清中是否存在TSHβ剪接变体蛋白；运用RT-PCR和Western Blot方法分别从转录和翻译两个水平检测人外周血白细胞(peripheral blood leukocyte, PBL)中TSHβ剪接变体表达情况；制作人PBL涂片,运用免疫荧光染色检测人PBL中TSHβ剪接变体的表达。2.人TSHα与TSHβ剪接变体体外结合验证实验：构建pSELECT-GFPzeo-TSHβ剪接变体和pcDN A3.1D/V5-His-TOPO-TSHα两个重组表达载体,分别转染入CHO细胞系,建立能稳定表达TSHβ剪接变体和TSHα的CHO细胞系,将上述两种CHO细胞系混合培养后,取培养上清,利用免疫共沉淀技术验证人TSHα是否能与TSHβ剪接变体形成二聚体。3.不同病理生理条件对TSHβ剪接变体表达影响：定量PCR检测GD和HT患者PBL中TSHβ剪接变体的表达差异；分离培养人PBL,分别给予致炎因子LPS (10mg/L)、抗炎因子地塞米松(10-6,10-7and10-8M)、TRH (100nM)和T3(100nM)直接刺激,定量PCR技术检测人PBL中TSHβ剪接变体mRNA表达差异。4.人TSHβ新剪接变体蛋白的原核表达及纯化：采用PET高效大肠杆菌表达系统对人TSHβ剪接变体进行表达并利用免疫亲和层析技术纯化获得重组人TSHβ剪接变体蛋白。结果1.鉴定出人血清中存在TSHβ剪接变体蛋白,正常人PBL仅表达TSHβ剪接变体而不表达天然型TSHβ,免疫荧光染色显示人PBL中有TSHβ剪接变体阳性表达细胞。2.成功构建pSELECT-GFPzeo-TSHβ剪接变体和pcDNA3.1D/V5-His-TOPO-TSHα两个重组表达载体；建立能稳定表达TSHβ剪接变体和TSHα的CHO细胞系；免疫共沉淀技术证实人TSHα能与TSHβ剪接变体形成二聚体。3. TSHβ剪接变体在GD和HT患者PBL中的表达差异：与正常人相比,HT初发患者(未经任何药物治疗)PBL中TSHβ剪接变体mRNA表达量上调123.33%(n=10,P<0.0001)、发病初期曾使用强的松治疗3个月但病程≥18个月的HT患者PBL中TSHβ剪接变体mRNA表达量上调76.67%(n=5,P=0.023)而发病初期曾使用强的松治疗3个月,病程≤9个月的HT患者PBL中TSHβ剪接变体mRNA表达量下调40%(n=8, P<0.0001)。GD初发患者PBL中TSHβ剪接变体mRNA表达下调(P<0.0001)。人PBL中TSHp剪接变体mRNA表达水平与血清FT3水平负相关(r=-0.635, P<0.001)、KFT4水平负相关(r=-0.760, P<0.0001)、TSH水平正相关(r=0.975,P<0.0001)。4.单次给予致炎因子LPS刺激后,人PBL中TSHβ剪接变体mRNA表达变化趋势是先增高后下降最后恢复至正常。与正常对照组相比,LPS处理6h组TSHβ剪接变体mRNA表达量增高(P=0.003), LPS处理12h组TSHβ剪接变体mRNA表达量下降(P=0.008),LPS处理24h、48h组TSHβ剪接变体mRNA表达量与正常对照24h、48h组差异无统计学意义。抗炎因子地塞米松抑制TSHβ剪接变体mRNA表达并呈时间浓度依赖性。5.TRH作用人PBL6h时,TSHβ剪接变体mRNA表达量增高(P<0.0001),随后逐渐恢复正常表达水平。T3作用人PBL12h时,TSHβ剪接变体mRNA表达量下降至最低(P=0.043),12h后逐渐恢复正常表达水平。6.成功构建PET-28a-TSHp剪接变体重组表达载体,经IPTG诱导表达,免疫亲和纯化,最后获得了7.4mgTSH(3剪接变体蛋白,纯度大于90%。结论(1) TSHβ剪接变体既可以存在于外周血循环中,以远距分泌(telecrine)方式发挥生物学作用,也可以表达于免疫细胞,以旁分泌(paracrine)的方式发挥调节作用。(2)人TSHα能与TSHβ剪接变体形成二聚体,该研究结果对于证明它的稳定性和是否具有高度生物活性至关重要。(3) TSHβ剪接变体可能参与了HT患者的甲状腺病理损伤。机体在不同状态下,TSHβ剪接变体可能受HPT轴和/或免疫系统调控。(4)纯化获得的TSHβ剪接变体蛋白将为TSHβ剪接变体功能及调控机制的深入研究提供重要的物质基础。