【摘 要】
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目的:研究表明,任何睾丸位置的异常都伴随着睾丸引带（Gubernaculum）的发育不良,因而影响睾丸引带发育的因素越来越受到重视。胰岛素样因子3（Insulin-Like Factor 3,INSL3）被认为是影响睾丸经腹下降期的关键因素,能刺激睾丸引带增生,调控其生长发育。本实验旨在通过体外培养小鼠睾丸引带细胞模型,检测INSL3对小鼠睾丸引带细胞增殖、凋亡的影响以及下游PKA、ERK通路的激
【基金项目】
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国家自然科学基金青年基金（81801432）； 广东省自然科学基金（2020A1515010135,2018A030307045）；
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目的:研究表明,任何睾丸位置的异常都伴随着睾丸引带（Gubernaculum）的发育不良,因而影响睾丸引带发育的因素越来越受到重视。胰岛素样因子3（Insulin-Like Factor 3,INSL3）被认为是影响睾丸经腹下降期的关键因素,能刺激睾丸引带增生,调控其生长发育。本实验旨在通过体外培养小鼠睾丸引带细胞模型,检测INSL3对小鼠睾丸引带细胞增殖、凋亡的影响以及下游PKA、ERK通路的激活情况;同时检测PKA/ERK信号通路被阻断后INSL3对睾丸引带细胞增殖、凋亡的影响,了解PKA/ERK信号通路在INSL3影响小鼠睾丸引带细胞增殖、凋亡的作用,或有助于揭示INSL3影响睾丸下降发育的机理。材料与方法:将出生3d龄的雄性昆明小鼠剖出其睾丸引带组织并进行细胞培养。传代培养后取对数生长期细胞,引带细胞随机分为实验组（INSL3,INSL3+PKA酶抑制剂（H89）,INSL3+ERK酶抑制剂（PD98059）,INSL3+H89+PD98059）、和对照组。用细胞增殖实验（Cell Counting Kit-8,CCK8）检测各组细胞不同时间段（24h、48h、72h）增殖情况;干预持续作用48h后,用蛋白质印迹法（Western Blot,WB）检测各组细胞增殖标记因子Ki67、PCNA;凋亡相关蛋白Bax,Caspase3、Bcl-2的表达变化以及相关通路蛋白PKA/ERK激活情况。结果:1.小鼠睾丸引带组织易于获取,小鼠睾丸引带细胞呈成纤维细胞型生长,传代后细胞同源性好,存活率高。2.CCK-8:INSL3组细胞增殖速率较对照组快,培养24h即出现增殖的差异（P<0.05）,48h、72h这种差异更加明显（P<0.001）,INSL3+H89,INSL3+PD98059,INSL3+H89+PD98059三组的增殖趋势较为一致,增殖速率均较INSL3组慢,24h即出现差异（P<0.05）,48h、72h差异更加明显。INSL3+PD98059,INSL3+H89+PD98059两组抑制最为明显（P<0.001）。3.Western Blot :1)增殖相关蛋白:INSL3组与对照组相比Ki67、PCNA表达量均增多,有统计学差异（P<0.01）,INSL3+H89,INSL3+PD98059,INSL3+H89+PD98059三组分别与INSL3组比较Ki67、PCNA表达量均下降,有统计学差异（P<0.05）。INSL3+H89+PD98059组分别与INSL3+H89,INSL3+PD98059两组相比Ki67表达均下降,有统计学差异（P<0.01）,而PCNA表达量均无统计学差异（P>0.05）。2)凋亡相关蛋白:INSL3组与对照组相比Bax、Caspase3表达量均下降,Bcl-2表达量均增加,均有统计学差异（P<0.05）;INSL3+H89,INSL3+PD98059,INSL3+H89+PD98059三组分别与INSL3组比较Bax、Caspase3表达量均增多,Bcl-2表达量均下降,均有统计学差异（P<0.05）。INSL3+H89+PD98059组与INSL3+H89、INSL3+PD98059两组相比Caspase3表达量均下降,有统计学差异（P<0.05）。INSL3+H89+PD98059组与INSL3+H89组相比Bcl-2表达量下降、Bax表达增多,均有统计学差异（P<0.05）,与INSL3+PD98059组相比Bcl-2、Bax表达变化无明显统计学差异（P﹥0.05）。3)相关信号通路蛋白:INSL3组与对照组相比p-PKA/PKA、p-ERK/ERK比值均升高,有统计学差异（P<0.01）;INSL3+H89,INSL3+PD98059,INSL3+H89+PD98059三组与INSL3组比较p-PKA/PKA、p-ERK/ERK均有不同程度下降,有统计学差异（P<0.01）,INSL3+H89+PD98059组与INSL3+PD98059组相比p-PKA/PKA比值均下降,有统计学差异（P<0.05）,INSL3+H89+PD98059组与INSL3+H89组相比p-ERK/ERK比值下降明显,有统计学差异（P<0.05）,与INSL3+PD98059组相比无明显差异（P﹥0.05）。结论:1.INSL3对小鼠睾丸引带细胞有促进增殖及抑制凋亡作用。2.PKA和ERK细胞信号通路参与了INSL3对引带细胞的促增殖及抗凋亡作用。3.INSL3可上调小鼠睾丸引带细胞ERK和PKA蛋白磷酸化,提示INSL3通过激活PKA/ERK信号通路调节小鼠睾丸引带细胞的的增殖和凋亡。
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