宫颈癌是妇女恶性肿瘤中第四常见的癌症,被认为是高危人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)长期感染的不良结果。大约10%的感染患者发生癌前病变,其中少部分会进展为宫颈癌。HPV疫苗和宫颈癌筛查的普及可有效地降低宫颈癌的发生率。但是宫颈癌存活率并不理想,尤其是晚期患者,同步放化疗是晚期宫颈癌的标准治疗选择。其5年总生存率不足70%,无病生存率仅为58%。然而,治疗性疫苗通过调节宿主体内的免疫系统,从而激发抗肿瘤反应,可能是治疗宫颈癌的一个潜在有效的方法。聚肌胞苗酸(Polyriboinosinic-polyribocytidylic acid,Poly(I:C))是一种人工合成的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)类似物,是目前研究最广泛的抗肿瘤疫苗佐剂之一。它可以通过胞内和胞外两种方式激活细胞的先天免疫,并调节适应性免疫,引起一系列免疫炎症因子的释放,发挥抑制肿瘤的作用;此外,对于不同的细胞,poly(I:C)激活Toll样受体3(toll-like re ceptor3,TLR3)、黑色素瘤分化相关抗原5(melanoma differentiation-associated gene 5,MDA5)和维甲酸诱导基因I(retinoic acid inducible gene I,RIG-I),可以起到不同的效应,主要是通过不同途径抑制肿瘤生长,如抑制肿瘤细胞的增生、诱导肿瘤细胞凋亡和促进肿瘤细胞坏死。肿瘤微环境由细胞成分和非细胞成分构成,细胞成分包括肿瘤细胞、免疫细胞和成纤维细胞,非细胞成分包括细胞因子、细胞基质和激素等,而免疫细胞的浸润是肿瘤微环境的标志之一。各种类型的免疫细胞均可浸润肿瘤局部,巨噬细胞是其中最常见的一类。其属于先天性免疫系统,主要作用是识别、吞噬抗原并呈递至T细胞,可以调节获得性免疫应答活性,是先天免疫和获得性免疫之间连接的纽带。宫颈癌具有免疫原性,大量的免疫细胞出现在肿瘤微环境中,poly(I:C)在宫颈癌中的免疫治疗效应及其机制目前研究尚有不足,还需进一步探讨。新生血管的生成对肿瘤的进展和转移有着决定作用,要降低肿瘤的转移和复发,首先要阻止新生血管的生成,这亦是当前肿瘤靶向治疗的研究热点。既往研究发现,宫颈癌组织内微血管密度(microvessel density,MVD)显著高于正常组织,且与淋巴结转移、周边浸润及浸润深度无明显相关,而且MVD越高,其复发率越高。近来有报道poly(I:C)可以联合药物降低裸鼠体内的子宫平滑肌瘤的体积和血管密度,那么poly(I:C)对宫颈癌组织的血管生成作用如何,目前尚无详细报道,为此我们设计了以下研究,探讨poly(I:C)对宫颈癌细胞与肿瘤浸润巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)相互作用的影响及机制;以及 poly(I:C)对宫颈癌血管生成的作用。第一部分poly(I:C)对宫颈癌细胞与肿瘤浸润巨噬细胞募集作用的影响目的肿瘤微环境形成的特点之一即是免疫细胞浸润,这些免疫细胞包括各种T淋巴细胞、不同极化的巨噬细胞及树突状细胞。肿瘤浸润免疫细胞中最常见的细胞类型是属于先天免疫系统的巨噬细胞。poly(I:C)作为有效的佐剂,可以提高多肽疫苗诱导的特异性抗肿瘤免疫应答,但是其作用机制尚未可知。本研究利用transwell小室实验分析poly(I:C)对宫颈癌细胞与肿瘤浸润巨噬细胞的募集的影响,并进一步观察裸鼠宫颈癌移植瘤组织中注射poly(I:C)之后的巨噬细胞浸润的变化,为poly(I:C)在宫颈癌治疗中的应用提供新的理论依据。方法1.观察poly(I:C)处理是否影响宫颈癌细胞对巨噬细胞的募集,利用transwell小室建立的迁移模型来检测这种募集。THP-1来源的巨噬细胞被放置在腔室的上部,下部腔室充满了有/无poly(I:C)作用的宫颈癌细胞条件培养基(conditioned medium,CM)。24h后观察迁移性巨噬细胞的数量。2.建立裸鼠宫颈癌移植瘤模型,待瘤体平均大小约0.6cm时,随机分为两组,分别瘤内局部注射PBS和poly(I:C),每5天用药一次,用药5次后取出移植瘤,免疫组化方法观察两组裸鼠移植瘤内巨噬细胞数量的差别。结果1.Poly(I:C)刺激的宫颈癌细胞CM明显促进THP-1来源巨噬细胞的募集。2.裸鼠宫颈癌移植瘤模型中poly(I:C)组移植瘤内F4/80数量明显大于PBS组。结论在体内体外Poly(I:C)刺激促进宫颈癌细胞对巨噬细胞的募集。第二部分poly(I:C)对宫颈癌细胞与肿瘤相关巨噬细胞细胞因子表达作用及机制的研究目的poly(I:C)激发天然免疫细胞中不同细胞群抗原的产生和表达,从而引起抗肿瘤后天免疫系统。除了对免疫细胞的作用外,Poly(I:C)还可以通过多种凋亡通路诱导细胞凋亡,肿瘤微环境在此过程中起着重要的作用。poly(I:C)对宫颈癌与肿瘤微环境之间是否有影响及机制如何,目前还没有得到充分的探讨。本研究将分析poly(I:C)对宫颈癌细胞及肿瘤浸润巨噬细胞分泌谱的影响及其机制,并利用宫颈癌裸鼠移植瘤模型进一步验证。方法1.用悬浮芯片和荧光定量PCR检测poly(I:C)对宫颈癌细胞多种促炎及抗炎因子分泌的影响2.用ELISA方法检测Poly(I:C)对宫颈癌IL-6表达的调控是否与其浓度和作用时间相关。3.用荧光定量PCR和ELISA方法研究poly(I:C)处理宫颈癌对巨噬细胞细胞因子表达谱的影响。4.研究IL-6是否参与宫颈癌巨噬细胞的分泌调节。首先用对照基因或IL-6 siRNA转染HeLa细胞,抑制IL-6的表达。转染36 h后加入25g/mL poly(I:C),培养12h后收集CM。然后在THP-1诱导巨噬细胞分化的过程中加入CM。在完全分化为THP-1来源的巨噬细胞后,检测细胞因子的转录水平和分泌水平。5.研究IL-6是否参与了宫颈癌细胞对巨噬细胞的募集。THP-1来源的巨噬细胞被放置在腔室的上部,下部腔室充满了 50%的敲除IL-6后未经/经polyIC处理的HeLaCM。并分别设置对照组,24h后观察迁移性巨噬细胞的数量。6.利用western和ELISA方法检测poly(I:C)对宫颈癌细胞作用的相关分子通路。7.建立裸鼠宫颈癌模型,利用体内实验检测poly(I:C)对宫颈癌细胞因子分泌影响。结果1.悬浮芯片和荧光定量PCR结果显示HeLa细胞及CaSki细胞中细胞因子表达基本一致,均不分泌 IL-1β、IL-10、IL-12,而 IL-2、IL-4、IFN-γ、MCP-1 及TNF-α分泌水平较低,且Poly(I:C)处理对这些因子的分泌水平无明显的促进作用。HeLa细胞及CaSki细胞分泌较高水平的IL-6,poly(I:C)处理后显著上调了IL-6的表达水平。2.Poly(I:C)对宫颈癌HeLa细胞及CaSki细胞中IL-6的表达呈剂量依赖性,25μg/mL时影响显著。两株宫颈癌细胞经poly(I:C)处理2h后,IL-6分泌量均有上调。在HeLa细胞中,经poly(I:C)处理10h后,条件反射区IL-6水平相对稳定,而在poly(I:C)处理的前12h,CaSki细胞IL-6水平持续升高.3.我们收集了含poly(I:C)处理和不含poly(I:C)处理的宫颈癌细胞的CM。用PMA诱导THP-1单核细胞系分化为巨噬细胞过程中加入这种条件培养基。结果显示不含poly(I:C)处理的HeLa细胞条件培养基能抑制THP-1衍生巨噬细胞中促炎性细胞因子IL-1和IL-6的表达,而IL-10和CCL22的转录和分泌水平明显升高。相比之下,12h的poly(I:C)处理几乎完全逆转了 HeLa细胞条件培养基对THP-1衍生巨噬细胞分泌的影响。4.利用siRNA抑制HeLa细胞IL-6表达后经poly(I:C)处理,CM对THP-1来源巨噬细胞转录和分泌促炎性细胞因子IL-lβ及IL-6表达的促进作用被抑制,而对IL-10及CCL22表达无明显变化。5.poly(I:C)刺激的宫颈癌细胞CM明显促进THP-1来源巨噬细胞的迁移。本研究进一步探讨IL-6在此过程中的作用。与对照组相比,IL-6 siRNA转染的HeLa细胞条件培养基对巨噬细胞的募集作用明显被抑制。6.本研究发现在HeLa细胞中,poly(I:C)作用5min后NF-κB磷酸化水平上调,在30min时达到高峰,表明信号通路被激活。为了探讨活化的NF-κB信号通路是否参与poly(I:C)调节的IL-6表达,使用常见的NF-κB信号通路抑制剂DDTC(4g/mL)预处理HeLa细胞1 h,然后改变培养基,加入poly(I:C)。EIISA结果表明,PDTA显著地逆转了 poly(I:C)对HeLa细胞分泌IL-6的影响。7.体内模型中poly(I:C)组裸鼠血液中IL-6分泌明显高于PBS对照组。结论poly(I:C)作用于宫颈癌细胞,促进来源于THP-1的Ml型巨噬细胞分泌IL-Iβ和IL-6细胞因子,而对M2型巨噬细胞分泌的细胞因子IL-10和CCL22的表达有抑制作用,通过NF-κB信号通道能上调IL-6的表达,并由此促进巨噬细胞募集。最终改变整个肿瘤微环境的免疫状态。第三部分poly(I:C)对宫颈癌血管生成的作用目的新生血管的生成影响肿瘤的生长,肿瘤的侵袭和转移亦依赖于其生成。肿瘤细胞从这些新生的血管获得充足的营养物质,并且其还是肿瘤细胞浸润转移的必要条件。早期肿瘤浸润和转移是宫颈癌不良预后的首要因素,这些不良预后因素一直困扰着临床决策。抗肿瘤血管生成的靶向药物以其副作用小,耐药低,作用广而广受临床的青睐,poly(I:C)作为抗肿瘤药物的佐剂,其免疫方面的作用已被研究了几十年,但是其在肿瘤血管生成方面的应用研究尚缺乏有力依据。本研究建立宫颈癌移植瘤模型,经poly(I:C)刺激裸鼠移植瘤后,用免疫组化的方法检测移植瘤内的微血管密度,并结合超声造影对移植瘤内血管功能的评价,来分析poly(I:C)对宫颈癌血管生成的作用。方法建立裸鼠宫颈癌皮下移植瘤模型12只,并随机分为用药组和对照组两组,在宫颈癌细胞注入10天后,肿瘤平均大小约0.6cm时,分别瘤内注射PBS、Poly(I:C)(50μg/只),5天给药一次,总共给药5次。用药后,每天观察裸鼠的饮食,精神等日常情况,裸鼠肿瘤的大小每3天测量一次。在末次给药后第4天行超声造影检查,获得移植瘤超声造影的图像资料,用超声造影定量分析软件进行脱机分析。超声造影检查之后处死裸鼠,完整取出肿瘤,用免疫组化方法检测移植瘤组织中CD31和CD34的表达,同时计算移植瘤组织内的微血管密度。结果1.裸鼠一般情况:随着药物的作用时间延长,PBS组裸鼠移植瘤渐渐长大,饮食,活动及精神均较前减弱;Poly(I:C)组裸鼠与用药前相比,无明显改变。2.裸鼠移植瘤大小的变化用药后,发现PBS组裸鼠移植瘤增长速度没有明显变化,而poly(I:C)组用药后移植瘤生长明显减慢,根据测定的移植瘤大小绘制生长曲线。实验结束时实验组移植瘤体积明显小于PBS对照组,两组间比较差异显著(p<0.05)。3.裸鼠移植瘤CD31和CD34免疫组化结果CD31和CD34作为靶向标志物,这两种物质被染成棕黄色,位于血管内皮细胞的胞浆,计数PBS组和Poly(I:C)组CD31和CD34 MVD平均值。两组比较实验组MVD值明显减低,且差异显著(p<0.05)。4.超声造影软件定量分析移植瘤内的血流灌注情况超声造影显示,PBS组移植瘤在造影剂注射后,移植瘤周边慢慢呈环状强化,poly(I:C)组强化不明显。根据不同时间两组移植瘤内的超声造影强度的变化绘制移植瘤造影时间强度曲线。超声造影软件定量分析显示,PBS组和Poly(I:C)组超声造影峰值强度分别为-23.31±0.74db,-52.89±0.41db,PBS组峰值强度明显高于poly(I:C)组,两组比较差异显著(p<0.05)。结论Poly(I:C)可以有效的抑制裸鼠宫颈癌皮下移植瘤的生长和瘤内血管的生成。