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氯离子通道蛋白(Chloride channels,CLCs)是一类重要的阴离子通道蛋白,在原核细胞和真核细胞广泛存在,就植物而言,它被认为与细胞膨压、渗透调节、离子稳态、胞内pH、气孔运动、营养物质运输等功能有关。本课题组已对目前报道的包含拟南芥、大豆、水稻等多种植物的CLC同源基因以及其编码蛋白进行了系统的生物信息学分析,且利用有关生物信息学软件,对大豆CLC同源基因家族进行了系统的预测和分析,发现大豆除GmCLC1基因之外的其他7个CLC同源基因序列,依次命名为GmCLC-b1、-b2、-c1、-c2、-d1、-d2、-g,本课题组已对上述基因完成基因克隆、测序验证和比较,并且研究了盐胁迫下大豆CLC同源基因的表达,发现转GmCLC-b1、GmCLC-b2、GmCLC-c2基因的拟南芥突变体耐盐性较高。本课题主要选取GmCLC-b1和GmCLC-c2为研究对象,基于定点突变(site-directed mutagenesis,SDM)技术和酵母氯离子通道缺失突变体△gef1,研究GmCLC-b1和GmCLC-c2基因功能。本研究将大豆GmCLC-b1和GmCLC-c2基因构建到酵母表达载体pYES2中,并将其三个高度保守区:(Ⅰ)GxGIPE(Ⅱ)GKxGPLVH 和(Ⅲ)PVGGVLFALEx 中的关键氨基酸x和非保守区的几个氨基酸突变为其他氨基酸,将测序成功的pYES2-GmCLC-b1和pYES2-GmCLC-c2菌液提取质粒,转入酵母氯离子通道缺失突变体△gef1中。主要研究结果如下:在盐胁迫下,GmCLC-b1蛋白保守区Ⅰ的G166E、P167L,保守区Ⅱ的E210A不能使酵母氯通道缺失突变体△gef1恢复生长,同时非保守区T437I突变体也不能使酵母氯通道缺失突变体△gef1恢复生长。保守区Ⅲ的E277G和非保守区的D601H/P605S双突突变体均能在一定程度上恢复酵母氯通道缺失突变体△gef1的生长。据文献报道保守区Ⅰ的x如果是P(Proline)脯氨酸则优先转运NO3-,如果是S(Serine)丝氨酸则优先转运Cl-,GmCLC-b1蛋白保守区Ⅰ的x为P(Pro),将GmCLC-b1保守区Ⅰ的P(Pro)突变为L(Leu)后发现P167L在盐胁迫下不能使酵母氯通道缺失突变体△gef1恢复生长,将保守区Ⅰ的P(Pro)突变为S(Ser)后发现P167S在盐胁迫下能使酵母氯通道缺失突变体△gef1恢复成长,且P167L、P167S在KN03胁迫下生长均受到一定抑制。通过测定酵母体内C1-含量,发现野生型BY4741、△gef1/GmCLC-b1,保守区 G166E、P167L、P167S、E210A、E277G,非保守区 T437I、D601H/P605S 双突突变体均无显著变化。说明GmCLC-b1蛋白表现为阴离子转运活性,虽然本酵母试验中未见Cl-转运属性,但本试验可初步推测GmCLC-bl蛋白优先转运N03-。在盐胁迫下,GmCLC-c2蛋白保守区的S184F、S184P、E227V、E294G四个突变体均无法恢复酵母氯通道缺失突变体△gef1的生长。非保守区C638F、A746T单突突变体,非保守区Ⅰ71V/C165Y双突突变体均能在一定程度上恢复酵母氯通道缺失突变体△gef1的生长。通过测定酵母Cl-含量,发现保守区的S184F、S184P、E227V、E294G突变体的Cl-含量均显著低于野生型BY4741。GmCLC-c2蛋白保守区Ⅰ的x为S(Ser),且在KN03处理下发现S184P受抑制程度低于S184F受抑制程度。说明GmCLC-c2蛋白表现为阴离子转运活性,可初步推测该蛋白优先转运Cl-。