论文部分内容阅读
裂谷热(Rift Valley fever,RVF)是一种由蚊媒传播的人兽共患传染病,该病病原体分离于肯尼亚境内的东非裂谷区域,并得名为裂谷热病毒。裂谷热的临床症状在人类主要表现为发热、头疼,严重的可致神经紊乱、视力减退、出血热甚至死亡。1950-1998年,裂谷热疫情主要发生于非洲大陆,并造成了上千人的死亡。2000 年,暴发于沙特阿拉伯的裂谷热疫情是首次发生在非洲大陆以外地区的疫情,此次疫情造成了上百人死亡。2016年,我国也出现了首例输入性病例。这说明裂谷热已出现跨区域传播的趋势。目前尚无获批的疫苗或药物用于裂谷热的防控与治疗,因此研发裂谷热病毒疫苗及抗病毒药物对裂谷热的防治具有重要意义。基于此,本研究构建了重组人4型腺病毒为载体的裂谷热疫苗,将此候选疫苗免疫恒河猴,从恒河猴体内筛选裂谷热病毒中和抗体以期为裂谷热的治疗提供一种新的方法,并通过中和抗体表位鉴定以期为裂谷热疫苗的研发提供理论依据。首先是免疫原的制备。以人4型腺病毒为载体构建表达裂谷热病毒Gn和Gc蛋白的重组人4型腺病毒,并命名为HAdV4-GnGcopt。结果显示,HAdV4-GnGcopt可以在HEK293细胞中较好地表达裂谷热病毒Gn和Gc蛋白。同时,利用哺乳动物悬浮细胞Expi293F对截短型Gn蛋白(154-469aa)和Gc蛋白(691-1119aa)进行表达,结果显示Gn和Gc蛋白均得到了良好表达。最后,利用StrepTrap亲和层析柱对Gn和Gc蛋白进行纯化。利用HAdV4-GnGcopt对恒河猴进行两次免疫后,再利用纯化后的截短型Gn和Gc蛋白对恒河猴进行加强免疫。然后通过ELISA对Gn和Gc蛋白结合抗体的水平进行分析。结果显示,HAdV4-GnGcopt及Gn和Gc蛋白成功激发了恒河猴体内Gn和Gc蛋白结合抗体的产生。随后,利用单细胞分选技术对恒河猴外周血中的Gn或Gc蛋白特异的记忆B细胞进行筛选,总计分选记忆B细胞1253个,约占分选前总细胞数的0.2%。然后,利用单细胞PCR技术对188个记忆B细胞中的抗体基因进行扩增,共筛选获得配对的抗体有104株,其中57株抗体轻链为κ型,47株抗体轻链为λ型。最后,通过ELISA筛选获得Gn蛋白结合抗体11株,Gc蛋白结合抗体有24株。为了检测免疫后恒河猴血清中和抗体含量以及针对Gn和Gc蛋白的结合抗体中和活性的测定,利用反向遗传技术成功拯救了表达eGFP和Renilla luciferase的裂谷热病毒MP-12株,分别命名为RVFV-SeGFP和RVFV-SRluc。然后,对裂谷热病毒的易感细胞系进行了鉴定。结果显示,Huh7(人肝癌细胞系)为裂谷热病毒的易感细胞。利用RVFV-SeGFP对恒河猴首免后第210天的血清抗体效价进行了测定,结果显示HAdV4-GnGcopt及Gn和Gc蛋白成功激发了恒河猴体内针对裂谷热病毒的中和抗体。然后利用RVFV-SRluc对11株Gn蛋白结合抗体和24株Gc蛋白的结合抗体的中和活性进行了测定,结果显示只有2株针对Gn蛋白的结合抗体(1332F11和1331E4)具有较好的中和活性,且二者的IC50分别为0.1678 μg/mL和0.3388 μg/mL。利用构建Gn截短突变体的方法对1332F11和1331E4的结合肽段进行了初步鉴定,虽然1332F11和1331E4是两株不同的抗体,但结果显示二者都结合于多肽409GSKKCTGDAAFCSAY423。利用丙氨酸扫描突变对这两株抗体的关键氨基酸进行了鉴定,结果显示1332F11和1331E4的关键氨基酸较为相似。根据已得到的关键氨基酸位点,利用软件Discover Studio 4.5对1332F11和1331E4与Gn蛋白进行分子对接并筛选抗原-抗体复合物最优构象。结果显示,虽然1332F11和1331E4通过不同的方向与Gn结合,但是它们都靠近Gc蛋白中的融合环。最后,我们根据抗原-抗体复合物构象推测1332F11和1331E4是通过相同的方式来发挥中和作用的,当这两株抗体与病毒颗粒表面的糖蛋白结合后可以阻止糖蛋白的结构重排,使Gc蛋白中的融合环不能暴露于晚期内体膜。综上所述,本研究以人4型腺病毒为载体成功够建了表达裂谷热GnGc蛋白的重组腺病毒,且该重组腺病毒可以在恒河猴体内激发较高的结合抗体水平,因此可以进一步探究其作为裂谷热病毒候选疫苗的可行性。同时,构建了裂谷热病毒MP-12株的感染性克隆为裂谷热病毒疫苗的研发及抗病毒药物的筛选提供了重要的技术手段。最后,成功筛选获得了两株裂谷热病毒的猴源中和抗体并解释了其发挥中和作用可能的机制,为今后裂谷热感染患者的治疗和裂谷热疫苗的研发提供理论依据。