鱼腥蓝细菌PCC 7120中PrpJ1和PrpJ2在细胞氧化胁迫响应中的作用及其底物和互作蛋白研究

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鱼腥蓝细菌PCC7120(Anabaena sp. strain PCC7120)是一种光能自养的革兰氏阴性细菌,是研究细胞发育和信号传导的模式生物。在环境中缺乏化合态氮源的情况下,鱼腥蓝细菌PCC7120菌丝上5%-10%的细胞会分化为专一执行生物固氮功能的异形胞,维持整条菌丝的生长。在鱼腥蓝细菌PCC7120中prpJ1和prpJ2编码PP2C类的蛋白磷酸酶,二者氨基酸序列高度同源。prpJ1的缺失导致缺氮后异形胞发育不完整,缺少一种异形胞特异性糖脂。prpJ2的缺失对异形胞发育没有显著的影响,但是prpJ1和prpJ2的同时缺失则影响了异形胞发育的主要调控因子HetR的正常表达,并导致异形胞完全不能发育。同时,初步研究显示prpJ1和prpJ2可能参与细胞的抗氧化胁迫。本研究的目的是确定prpJ1和prpJ2参与鱼腥蓝细菌PCC7120的氧化胁迫响应过程,并寻找PrpJ1和PrpJ2蛋白的底物或者互作蛋白,以进一步研究prpJ1和prpJ2在异形胞发育和氧化胁迫响应过程中的作用机制。   本研究用甲基紫精(MV)作为氧化剂检测prpJ1的突变体S20、prpJ2的突变体S19,以及双基因突变体S19/S20的氧化胁迫耐受性,结果显示S19和S20对MV有一定的耐受性,而双突变体S19/S20具有显著的比野生型更强的对MV胁迫的耐受性。qPCR结果显示,在H2O2(10mmol/L)和MV(100μ mol/L)的氧化胁迫下,鱼腥蓝细菌PCC7120野生型中prpJ1和prpJ2基因均显著的下调表达,其中prpJ1在H2O2胁迫下的基因表达下调更高达10倍以上。由此推测这两个基因在鱼腥蓝细菌PCC7120抗氧化胁迫过程中具有一定的协同调节作用。   本研究通过Pull-Down和二维电泳这两种技术来寻找PrpJ1和PrpJ2蛋白的底物或者相互作用蛋白。在Pull-Down实验中,本研究首先获得以6×His-Tag标记的活性蛋白PrpJ1upN和PrpJ2upC。PrpJ1upN和PrpJ2upC均缺少了跨膜区和C段区域。体外酶活检测显示,二者仍具有蛋白磷酸酶活性。分别以这两个蛋白作为诱饵蛋白,从不同培养条件下(硝酸盐或氮源缺乏)鱼腥蓝细菌PCC7120菌株(WT或S20或S19)总蛋白中钓取与之相互作用的蛋白。经过多次检测,本研究没有获得特异性的互作蛋白。但在研究中发现,氮源缺乏24后S20突变体中PrpJ1可能存在特异性降解。同时我们提取了鱼腥蓝细菌WT,S20及S19氮源缺乏条件下的磷酸化蛋白,利用二维电泳技术,比较WT与S20或S19的磷酸化蛋白差异。结果显示,WT和S20或S19的磷酸化蛋白确实存在可以重复的差异,这些差异的磷酸化蛋白可能因为prpJ1或prpJ2的缺失而不能被正常去磷酸化或表达,因此很可能是prpJ1或prpJ2的底物。但是由于样品含量太低,不能进行质谱分析,因此还有待于进一步改进条件以获得更好的结果。
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