淡水南美白对虾急性肝胰腺坏死病模型的建立及防治中草药筛选

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南美白对虾(Litopenaeus Vannamei)原产于南美太平洋沿岸水域,是世界养殖产量最高的三大优良虾类之一,自1988年引入中国后,其养殖产业已逐渐发展为我国水产养殖业中的支柱产业。急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreas necrosis disease,AHPND)是严重危害对虾健康的疾病,自2009年暴发以来,已在全球范围内迅速传播开来。该病传播迅速且死亡率极高,到目前为止该病的防治措施尚不完善,一旦发病很难控制和治疗。本研究首先探讨了K+、Ca2+和Mg2+三种离子在南美白对虾淡化过程中的最适浓度,建立起淡水养殖模型,进一步建立急性肝胰腺坏死病模型,在此基础上,探究几种中草药复方和单方对南美白对虾急性肝胰腺坏死病的治疗作用,筛选最佳药物及其作用浓度,以期为后续探究中草药对急性肝胰腺坏死病的治疗提供理论依据和参考。同时构建pir ABvp基因的表达载体,纯化毒力蛋白,为后续制备单克隆抗体及其快速检测方法的建立提供支持。本研究首先应用不同浓度的K+、Ca2+和Mg2+离子处理虾苗,筛选最适的K+、Ca2+和Mg2+离子浓度,并逐步淡化至适于盐度为0.5‰以下的淡水池塘中养殖。结果显示,在虾苗淡化养殖过程中,当K+为219.73 mg/L,Ca2+为241.98 mg/L,Mg2+为484.85 mg/L时,可以使虾苗成活率达到最高,此时钠钾浓度比为20:1,钠钙浓度比为19:1,钠镁浓度比为9:1。在此条件下进行南美白对虾的淡化养殖,温度控制在25.5±1.5℃,pH值在8.3±0.2,养殖盐度从13‰淡化至1‰左右,最终投入盐度为0.5‰以下的淡水池塘中养殖,检测2周的成活率约95%。进一步通过测定一株副溶血弧菌(DX20210701)的半数致死量(LD50)及病理检测等建立了急性肝胰腺坏死病模型,其中LD50为1.8×10~5CFU/尾。本研究中选取4种中草药复方(1、2、3和5组)和5种中草药单方药渣(紫苏子、泽泻、山萸肉、钩藤、延胡索),通过熬制获得0.1 g/mL的中草药药液,将中草药复方药液分别按50 mL/500g、100 mL/500 g和200 mL/500g的剂量与饲料进行充分混合,中草药单方按50 mL/500g的剂量与饲料进行充分混合,选择体长6~7 cm的健康对虾进行随机分组,每组设2个平行组,分别投喂制备好的饲料,阳性对照组和阴性对照组投喂普通饲料,连续投喂7 d后进行人工感染副溶血弧菌试验,一个平行组观察各组对虾存活情况并计算存活率,另一个平行组采集对虾肝胰腺组织并检测组织中超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及酚氧化物酶原(ProPO)、甲壳素(Crustin)、免疫缺陷因子(IMD)、溶菌酶(lysozyme)、Rab蛋白和Grim-19基因的相对表达量,分析各中草药对对虾免疫功能的影响。结果发现,在感染副溶血弧菌后,延胡索组死亡率100%,1-200组、2-50组、2-100组死亡率为10%,5-200组死亡率为20%,2-200组死亡率为30%。在对对虾的免疫功能影响方面,各中草药组均能显著提高SOD酶的活力,其中在12 h时2-50组SOD活力显著高于阴性对照组和阳性对照组(P<0.01),达到27.61 U/mg;在24 h时,1-200组SOD活力显著高于阳性对照组,达到23.86 U/mg。各中草药组对虾肝胰腺中ProPO基因相对表达量表现为升高趋势,且在24 h内普遍表现为持续升高;对虾肝胰腺中Rab基因的表达情况普遍出现抑制现象;各中草药组IMD基因相对表达量普遍显著高于阴性对照组(P<0.01),且在24 h内,除3-50组、3-200组和5-200组外,各组基因表达量均表现为持续升高趋势;各中草药组溶菌酶基因相对表达量显著高于阴性对照组(P<0.01),在感染病原菌24 h内,除1-200组、5-200组和泽泻组基因表达量表现为先升高后降低趋势外,其余各组均表现为持续升高,其中紫苏子组基因表达量升高至阴性对照组的53倍,钩藤组达到阴性对照组的36倍;在24 h内1-200组、2-100组、3-200组、5-50组和泽泻组Crustin基因表达水平呈先升后降趋势,其余各组Crustin基因表达水平表现为持续升高趋势,且在24 h时1-100组、2-50组、2-200组、5-100组紫苏子组、山萸肉组和钩藤组Crustin基因表达水平显著高于阳性对照组(P<0.01);在24 h内各中草药组Grim-19基因相对表达量普遍升高,但低于阳性对照组,1-100组、1-200组、3-200组、5-200组和泽泻组基因表达水平呈下降趋势,其余各组基因表达水平持续升高,在24 h时山萸肉组和钩藤组基因相对表达量与阳性对照组相近。本研究通过总结感染试验各试验组中对虾的生存率,以及分析各中草药对对虾肝胰腺中免疫酶活和免疫相关基因的影响,最终筛选出对南美白对虾急性肝胰腺坏死病具有最佳治疗效果的中草药为中草药复方2组和中草药复方5组,对南美白对虾有一定的非特异性免疫效果,为后续探究中草药对急性肝胰腺坏死病的治疗提供理论依据和参考。
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