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小热休克蛋白(small heat shock protein,sHSP)是一类在不同物种中比较保守的蛋白,其分子量大小一般在12-43KDa。近年来研究发现sHSP与机体许多功能如细胞通讯、免疫反应、蛋白转运、凋亡、衰老及细胞周期调节等密切相关。同时也和哺乳动物某些疾病的发生如帕金森症、多发性硬化病及恶性肿瘤相关。然而sHSP在昆虫尤其是鳞翅目昆虫的生理功能研究并不多。柞蚕(Antheraea pernyi)是一种常见的绢丝昆虫,不仅具有很高的经济和医用价值,而且柞蚕丝也是纺织工业重要的原料。我们克隆了柞蚕小热休克蛋白20.8(Ap-sHSP20.8)和21.4(Ap-sHSP21.4)的基因序列,并对其免疫学功能及其作用机制进行了探讨。本研究结果主要包括以下四个方面:1.克隆获得了Ap-sHSP20.8和Ap-s HSP21.4基因序列并构建了原核表达载体。根据家蚕和其他鳞翅目昆虫的sHSP序列设计引物,经PCR克隆扩增获得了Ap-sHSP20.8和Ap-sHSP21.4基因序列。其中Ap-sHSP20.8基因开放阅读框(ORF)为561bp,有187个氨基酸组成,构建系统进化树表明Ap-sHSP20.8属于HSP20家族。而Ap-sHSP21.4基因序列全长1391bp,包括5’端非编码区194bp,由561bp组成编码187个氨基酸的的ORF及3’端633bp的费编码区。系统进化树显示Ap-sHSP21.4在进化关系上距离HSP20家族较远,可能属于另一进化分支。组织定量显示这两种sHSP在脂肪体分布较高。此外,构建了pet-28a(+)-Ap-sHSP20.8和pet-28a(+)-Ap-sHSP21.4原核表达载体。采用镍亲和柱进行纯化,制备了多克隆抗体,并在体外验证了Ap-sHSP20.8分子伴侣功能。为进一步研究Ap-sHSP20.8和Ap-sHSP21.4的功能奠定了基础。2.Ap-sHSP20.8和Ap-s HSP21.4对病原微生物的免疫反应。用E.coli,B.bassiana及NPV病原微生物注射入5龄3天柞蚕幼虫后,发现Ap-sHSP20.8和Ap-sHSP21.4的基因表达菌明显上调。虽然表达模式不同,但总体来说脂肪体Ap-sHSP20.8和Ap-sHSP21.4基因表达上调程度要比中肠明显很多。采用Western blot技术发现,免疫刺激后Ap-sHSP20.8蛋白表达也不同程度地上调。此外,采用si-Ap-sHSP21.4,基因敲除Ap-sHSP21.4后,发现免疫相关基因defensin,Dopa decarboxylase,Toll1,lysozyme和Kazal-type serine protease inhibitor的表达均明显下调。这些结果表明Ap-sHSP20.8和Ap-s HSP21.4在柞蚕的免疫系统中具有重要作用。3.类花生四烯酸代谢途径对柞蚕sHSP的调节。由于炎症反应会引起哺乳动物局部体温升高,而这种体温升高和HSP表达及类花生四烯酸代谢密切相关,昆虫的许多免疫反应机制与哺乳动物类似。鉴于此,我们用类花生四烯酸代谢途径中一些酶的抑制剂处理柞蚕幼虫后,再给予免疫刺激,发现Ap-sHSP20.8和Ap-sHSP21.4的基因和/或表达均明显下调,而花生四烯酸却能使其表达显著增加。表明Ap-sHSP20.8和Ap-sHSP21.4的免疫功能可能与类花生四烯酸的代谢相关。4.探讨了Ap-sHSP20.8与caspase-1之间的关系多数环境刺激不仅会引起sHSP的表达变化,也影响到细胞凋亡。而caspase酶在细胞凋亡中处于中心地位。采用RNAi技术把Ap-sHSP20.8基因敲除后热激,caspase-1的活性升高及基因表达明显升高。表明caspase-1可能是sHSP20.8的下游调节因子。此调节通路尚需进一步的细胞学验证。