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过氧化氢酶(Hydrogen-peroxide oxidoreductase EC 1.11.1.6),又可称为触酶(Catalase,简称CAT),能有效地催化分解H2O2为水和氧气。随着环境保护意识的增强,过氧化氢酶因其污染少、成本低、可提高印染质量等优点,广泛应用于食品、医药、纺织、造纸和污水处理等方面。CAT来源丰富,几乎存在于所有好氧生物中。目前市场上的CAT是动物肝脏CAT与微生物CAT共存的,微生物CAT因其优良的性质越来越受到研究者的亲睐。但由于纺织工艺的特殊性,目前的商品过氧化氢酶在完全达到纺织工业应用要求方面(最适p H>10,反应温度>50℃)尚有不足。因此,本文选择以具有较好热稳定性和嗜碱性,源自Thermus thermophilus HB27的锰过氧化氢酶为材料,构建毕赤酵母和大肠杆菌两个表达系统的重组菌,比较两种重组菌所产酶的酶学性质,对产耐热嗜碱酶的重组大肠杆菌进行摇瓶发酵优化,获得较高产量的锰过氧化氢酶。结果显示:(1)通过查阅文献和对NCBI基因库的生物信息学分析,确定了来源于具高热碱性的古细菌T.thermophilus HB27基因组上所含的锰过氧化氢酶(Mn CAT)的基因编码序列依据毕赤酵母的密码子偏爱性进行密码子优化后合成基因,连接至表达载体p PIC3.5K上,电转入毕赤酵母SMD1163中,经过MD板初筛及YPD/G418板的复筛,获得重组菌Pichia pastoris SMD1163/p PIC3.5K-Mn CAT,实现Mn CAT基因在毕赤酵母中的异源表达。对该酶进行纯化后,比酶活力为1.18×106 U/mg,提高了717倍,总蛋白回收率为3.63%;酶学性质分析,得到其最适温度和p H分别为55℃和8.0,在30℃时热稳定性最高,p H稳定性在6.0-9.0。Mn CAT的酶反应动力学常数Km值为27 mmol/L,最大反应速度Vmax值为13.4 mmol/(L·min)。Co2+、Zn2+对Mn CAT有明显的抑制作用。(2)通过共表达Mn2+转运蛋白Mnt H提高Mn2+的吸收速率,从而降低蛋白表达对培养基中高浓度Mn2+的需求,因此本研究以E.coli BL21(DE3)的基因组DNA为模板,扩增得到mnt H的DNA片段,构建Mnt H与Mn CAT的共表达基因工程菌E.coli BL21(DE3)/p ET28a-Mn CAT/p ACYC-mnt H。收集粗酶液进行蛋白纯化,比酶活力为1250.7 U/mg,提高了6.1倍,总蛋白回收率为27.2%。酶学性质分析显示其最适温度为90℃,热稳定范围是75℃-90℃;最适p H为10.6,在p H 8.0-10.6之间放置4h残留酶活为90%以上。Mn CAT的酶反应动力学常数Km值为60 mmol/L,最大反应速度Vmax值为20 mmol/(L·min)。Co2+对Mn CAT有明显的抑制作用。(3)比较上述两种重组菌的酶学性质后,重组大肠杆菌产的酶具有良好的耐热嗜碱性,因此,选择以工程菌E.coli BL21(DE3)/p ET28a-Mn CAT/p ACYC-mnt H为出发菌株,在摇瓶中进行发酵条件优化,确定培养基中最佳的碳氮源种类及其浓度分别为:甘油7.0 g/L,蛋白胨11.25 g/L和酵母粉3.75g/L;当培养基中Mn2+的浓度为1 mmol/L时,最佳的IPTG诱导浓度为0.05 mmol/L;此外,最佳的培养基初始p H值及培养温度分别为:p H 8.0和37℃,在最优发酵条件下,工程菌摇瓶发酵培养24 h,过氧化氢酶活最高可达476 U/m L是未优化前3倍。用优化后的发酵条件在5 L发酵罐中进行验证,检测酶活性可达1094 U/m L。综上所述,本研究实现了T.thermophilus HB27来源的Mn CAT基因在毕赤酵母中的高效表达和Mn2+转运蛋白Mnt H与Mn CAT在大肠杆菌中的共表达,研究了两种系统表达的重组酶的酶学性质,优化了重组大肠杆菌摇瓶发酵条件,获得了较高产量的耐热嗜碱锰过氧化氢酶。