水牛(Bubalus bubalis)是我国南方亚热带地区最重要的乳肉兼用型大家畜,是一种优良的种质资源。但是,水牛的繁殖效率较低,其中精子受精过程障碍是造成低受精率的重要因素。与体细胞不同,精子是高度特异分化的细胞,成熟精子的基因转录和翻译过程几乎处于沉默状态。精子获能是成功受精的先决条件,主要依赖于蛋白质的转运和翻译后修饰来实现。蛋白质组学已被广泛应用于哺乳动物精子发育和成熟研究,已发现了一批与精子获能有关的特殊蛋白质和酪氨酸磷酸化蛋白质,但在水牛生殖生物学研究领域尚未见报道。为了更好的了解水牛精子获能的潜在机制,本研究通过蛋白质组学技术探索水牛精子蛋白质在获能前后的动态变化,从蛋白质表达和翻译后修饰的角度分析影响精子获能的因素,为水牛生殖机理研究提供新的视角。本文的主要研究结果如下所示:一、水牛精子获能前后的定量蛋白质组学分析。使用TMT(Tandem Mass Tag)标记结合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)的策略对精子获能前后的蛋白质表达进行定量分析。结果显示,共鉴定1441个蛋白质,以未获能精子组作为对照组,获能精子组作为实验组,共得到差异表达蛋白质93个(差异倍数>1.2),其中上调表达蛋白质52个,下调表达蛋白质41个。对差异表达蛋白质进行生物信息学分析,GO分析显示,大部分差异表达蛋白质参与了转运、细胞骨架组织、有性生殖和精子发生等生物学进程。KEGG分析显示,差异表达蛋白质所参与的信号通路包括代谢通路、PPAR信号通路和SNARE互作通路(囊泡转运)等。STRING分析显示,鉴定得到的蛋白质之间具有复杂的相互作用关系,主要包括转运、糖酵解和磷酸化等。蛋白质印迹(Western Blot)证实了VAMP4和APOC3蛋白的表达量变化与质谱鉴定结果保持一致。二、水牛精子获能前后的磷酸化蛋白质组学分析。分别提取水牛精子获能前后蛋白质,富集磷酸化肽段后分别进行LC-MS/MS鉴定和生物信息学分析。实验结果显示,在未获能精子组中共鉴定得到260种磷酸化蛋白质,包含495个磷酸化肽段和848个磷酸化修饰位点。在获能精子组中共鉴定得到284种磷酸化蛋白质,包含627个磷酸化肽段和853个磷酸化修饰位点。韦恩(Venn)分析发现未获能精子组与获能精子组共有113个磷酸化蛋白质的交集,其中未获能精子组特有的磷酸化蛋白质有147个,获能精子组特有的磷酸化蛋白质有171个。对获得的两组磷酸化蛋白质数据进行GO分析发现,无论是细胞成分、生物学进程还是分子功能,获能精子组的显著性富集条目均多于未获能精子组,而且与精子获能过程密切相关。获能精子参与了更多的信号通路。在113个磷酸化蛋白质中,酪氨酸磷酸化蛋白质有28个,其中SYNE2和TAT1蛋白表达水平发生变化,ODF1和FSIP2修饰位点发生变化,它们可能成为精子获能的标志蛋白。综上所述,本研究构建了水牛精子获能前后的差异表达蛋白质谱和磷酸化蛋白质谱,有助于阐明蛋白质表达变化和翻译后修饰在精子获能过程中的调控作用,为提高水牛受精能力打下理论基础。