原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，死亡率亦高，居第二位。美国M.D.An-derson癌症中心的最近一项研究表明，原发性肝癌患者中约41%和每日大量饮酒有关，24%源于丙型肝炎病毒感染，10%由于乙型肝炎病毒感染所诱发，剩下的25%诱因不明。此研究结果同时指出，肝癌患者有一半左右在临床上可以被诊断为肝硬变。虽然目前欧美国家的肝癌发病率处于较低水平，但由于近年来其丙型肝炎发病率正呈逐年上升趋势，而丙型肝炎所致的肝硬变又是诱发肝癌的重要原因之一。签于以上原因，今后数内年欧美国家肝癌发病率将会有明显的提升。与欧美国家相比，我国的肝癌发病率位居世界首位，肝癌患者的年死亡人数约占全球肝癌患者死亡人数的50%左右，其发病率为欧美国家的10倍。我国肝癌发病率居高不下的原因有以下几点：（1）我国为肝炎大国，其中乙型和丙型肝发病率较高，而乙型和丙型肝炎均为肝癌的重要诱因之一；（2）某些地区有嗜好烈酒之风，长期过量的饮酒可以诱发肝硬变，而肝硬变也为肝癌的重要诱因；（3）某些地区卫生条件较差，霉变饮食中含有强力肝癌致病物质黄曲霉素。手术切除为肝癌获得根治的最佳手段，但肝癌发现多属于晚期，常伴肝硬化，手术难以切除，且术后容易复发。研究报道，根治性手术切除后，仍有60%-70%的患者在5年内出现转移和复发。肝癌现行治疗药物以氟尿嘧啶和阿霉素等最为常用，但这些药物也不尽如人意，存在着骨髓抑制、消化道反应、呕吐等严重的毒副作用，尤其对不能切除肝癌患者的治疗有效率过低且无明显延长生存期的效果。因此，关注并重视肝癌治疗药物的研究对我国有着十分现实和重要的临床意义和社会意义。槲寄生（Viscum album）是一类依赖落叶树木生长的半寄生植物的总称。在中国，槲寄生有着悠久的应用历史，中医用于治疗梅毒、淋病、风湿病和高血压等症，从中药槲寄生中制备的槲寄生凝集素蛋白表现出明显的诱导肿瘤细胞凋亡的作用。多年来，槲寄生凝集素（Viscum albumAgglutinin，VAA）在欧洲一直被作为肿瘤治疗的药物使用。槲寄生凝集素分为I、II、III三个亚型，其中I亚型（Viscum albumAgglutininI，VAA-I）的活性最强，对其报道的也最多。VAA-I由A和B两个亚基组成，其中B亚基可识别某些肿瘤细胞表面的特异性抗体，而A亚基则可进入细胞发挥其抗肿瘤作用。VAA-I的获得主要是采用传统的分离、提取方法从槲寄生中获得，由于其含量低，提取分离方法复杂，限制了其应用。也有人在大肠杆菌中对其进行了表达。但是，大肠杆菌作为原核表达体系表达外源蛋白存在很多缺点，例如表达的外源蛋白以包涵体的形式存在，增加了纯化的难度；表达的外源蛋白需要经过复杂的复性过程才能恢复蛋白的构象和活性；大肠杆菌细胞膜间隙中含有大量的内毒素，微量的内毒素即可导致人体发热反应。而毕赤酵母是低等真核生物，于20世纪80年代初开发获得。毕赤酵母非常有利于真核基因的表达，具有对外源表达蛋白进行正确加工，修饰及合理的空间折叠等功能，能有效克服大肠杆菌等原核表达系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足；同时，酵母细胞具有生产快，操作简单，易于培养等原核生物的优点。因此，毕赤酵母表达系统受到越来越多的重视，已广泛用于重组蛋白质的生产。迄今为止，应用毕赤酵母表达系统已成功表达了200多种蛋白，其中重组人胰岛素样生长因子、重组人血清白蛋白、重组人血小板衍生生长因子和乙肝疫苗等已进行了产业化和商品化。为将VAA-I发展成为相对安全、有效的抗肝癌药物奠定前期的工作基础，本文主要进行了以下三方面的研究。1．重组槲寄生凝集素毕赤酵母高效分泌表达体系的建立本部分研究首先根据GenBank上公布的VAA-I的蛋白质序列，通过酵母密码子氨基酸优化，合成适于在毕赤酵母中表达的基因序列。然后通过PCR的方法引入KpnI和EcoRI位点，并连入表达载体pPICZαA中的特定位置，成功电转化毕赤酵母。用SDS-PAGE和Western Blot分析了多个克隆中VAA-I的表达情况，其试管规模产量最高可达39mg·L^-1。应用KTA purifier蛋白纯化工作站，对其进行小规模纯化，其纯度可达97%，且分子量和氨基酸序列与预期相符。2．重组槲寄生凝集素中试规模发酵及纯化工艺研究本部分研究探讨了PH值、甲醇诱导时间、发酵温度、甲醇流加速度、溶解氧、培养基成分和消泡剂等在中试规模发酵过程中对rVAA-I表达的影响。rVAA-I进行中试规模发酵时，选择FM21为培养基，最佳pH为5.5，最适温度为28-30℃，转速为650r·min-1，溶解氧为25%，甲醇流加速度为9.3mL·h^-1·L^-1初始发酵液体积，诱导时间为96h。发酵液经硫酸铵分级沉淀、疏水层析和阳离子交换层析，纯度可达92%，收率在33%左右。3．重组槲寄生凝集素抗肝癌作用及机制的实验研究本部分研究通过MTT比色法证实rVAA-I可剂量依赖性的对SMMC7721细胞的增殖起到抑制作用，24小时的IC50为16ng/mL。流式细胞仪检测rVAA-I可以诱导SMMC7721细胞凋亡，透射电镜观察到了凋亡的典型形态学变化。通过研究Caspase抑制剂z-VAD-fmk对rVAA-I诱导细胞凋亡的影响，进一步证实了rVAA-I诱导细胞凋亡与Caspase有关。本研究同时也发现rVAA-I可以引起SMMC7721细胞内游离钙离子的释放增加和细胞色素C的释放。基因芯片的分析结果表明在，MAPK信号传导通路在rVAA-I杀伤SMMC7721细胞的过程中起着至关重要的作用，并通过实时定量PCR方法对其进行了验证。综上所述，本研究成功的建立了rVAA-I在毕赤酵母中的表达与纯化方法，随后对其中试规模的发酵工艺条件进行了优化。本研究同时证实，rVAA-I在体外对SMMC7721生长的抑制作用与凋亡有关，并通过基因芯片技术发现MAPK途径参与到了rVAA-I杀伤SMMC7721细胞的过程。