甘蓝等芸薹属植物的自交不亲和性在遗传上受一个带有复等位基因的多态性S位点(S-locus)控制,并且存在着一个以S位点基因介导的自交不亲和信号传导途径。但是,关于这条信号传导途径相关元件编码基因之间的连锁关系、以及它们与S位点的连锁关系和在甘蓝染色体上的具体位置分布至今未见报道。另外,甘蓝是芸薹属的三个基本种之一,在芸薹属的自然和人工合成过程中,甘蓝的染色体组参与的染色体配对行为十分普遍,染色体之间的重排率很高,极大地影响着甘蓝自交不亲和基因在芸薹属间的转移和遗传变异。因此,对自交不亲和基因进行染色体定位和DNA纤维定位,对芸薹属物种自交不亲和性的研究和利用具有十分重要的意义。本研究采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术,以MLPK和SSP基因片段为探针,分别在甘蓝有丝分裂前中期染色体、减数分裂早粗线期染色体以及伸长DNA纤维(extended DNA fibers,EDFs)等3种分辨率水平的靶DNA载体上进行全面的物理定位研究。旨在为孢子体型自交不亲和性机理和信号转导途径的明确以及自交不亲和性基因的遗传变异的研究提供全新内容,并为下一步甘蓝高分辨率物理图谱的构建和细胞遗传图谱的整合打下坚实的基础。主要研究结果如下:1.通过对相关程序的探索优化,建立了适合于甘蓝的FISH靶DNA载体制备技术流程,利用该技术体系成功制备出甘蓝有丝分裂前中期染色体、减数分裂早粗线期染色体以及伸长DNA纤维等3种层次的靶DNA载体。(1)本研究采用变温处理同步化诱导方法,使甘蓝有丝分裂前中期染色体分裂相比率达到80%以上,显著的提高了前中期染色体制片的分裂相数目。(2)甘蓝根尖在20℃条件下,采用0.002 mol/L 8-羟基喹啉预处理1h,效果最佳。(3)采用2%纤维素酶和2%果胶酶混合液37℃酶解约2h、0.075mol/L的KCl在25℃低渗30min的解离条件,制备的甘蓝前中期染色体效果最佳;采用2%纤维素酶和2%果胶酶混合酶液37℃解离约3h的方法,可获得伸展良好、背景干净的粗线期染色体。(4)采用改进的细胞核提取方法,制备出了分布较均匀、密度合适的细胞核;STE细胞核裂解液作用时间须控制在5～8min;采用分子梳理法成功制备出伸展程度较均匀,大多呈平行状态的DNA纤维。2.通过对相关相关技术参数的探索,建立了适用于3种伸长度染色体的FISH技术体系。在前中期和早粗线期染色体上采用的FISH程序基本一致,而EDFs-FISH中,制片无需进行前处理和预变性,杂交液中探针浓度以及杂交后洗脱温度略有不同,其余程序在3种载体上可保持一致。实验结果表明,均取得较好的杂交效果,证明该方法的可行性。(1)染色体杂交前处理是否充分直接影响到原位杂交的信号检出率和信噪比的高低。(2)前中期及早粗线期染色体在70%去离子甲酰胺中,70℃变性2min,效果最佳;若变性时间稍长,对前中期染色体的影响更为明显。(3)FISH的最佳杂交液组成为:50%(v/v)去离子甲酰胺、7.5%(v/v)硫酸葡聚糖、2×SSC、1.5ng/μL探针(EDFs-FISH 0.5ng/μL)、0.5%(w/v)SDS、0.5μg/μL ssDNA。(4)针对单、低拷贝探针的3级洗脱,37℃获得的杂交信号比较稳定,信噪比较高。对于EDFs-FISH,将温度提高到40℃,能更好地减少非特异信号,提高信噪比。(5)利用抗体偶联物进行信号的级联放大,对于杂交信号检出率的提高影响显著。3.在甘蓝前中期染色体上,MLPK与SSP探针都只在1对同源染色体上检测到绿色杂交信号。MLPK与5SrDNA探针信号存在于同一对染色体上,位于1对近中着丝粒染色体的短臂中部;SSP探针信号位于1对具有随体的近端着丝粒染色体的长臂端部。没有观察到同时出现在姊妹染色单体上的双点信号现象。MLPK探针的检出率为11.8%,SSP探针为9.1%。MLPK和SSP探针在甘蓝减数分裂早粗线期染色体上,1个分裂相内最多只观察到2个同源杂交信号,探针信号的检出率分别为31.4%和20.4%。4.本研究使用的伸长DNA纤维的分辨率约为1.5kb。在每条DNA纤维上,1.7kb的MLPK和1.2kb的SSP探针都呈现单个的绿色杂交信号点,推断MLPK与SSP在1条DNA纤维(染色体)上可能只有1个拷贝。综合分析MLPK与SSP在3种分辨率水平的靶DNA载体上的FISH结果判断,在甘蓝染色体组中MLPK与SSP基因可能都只有1个同源序列座位,初步证明二者在甘蓝单倍体基因组中的单拷贝性。5.依据Armstrong的核型分析标准初步判断,在甘蓝染色体组中MLPK位于2号染色体的短臂中部,信号距着丝粒的百分距离约为53.41±3.16;SSP位于具有随体的7号染色体的长臂端部,信号距着丝粒的百分距离约为78.36±4.26。MLPK、SSP以及S位点基因之间不存在连锁关系,分别位于不同的染色体上。