一.慢病毒载体对抗CD20抗体2F2表达的研究慢病毒(Lentivirus)载体区别于一般地逆转录病毒载体在于,它不仅能感染分裂细胞,同时对非分裂细胞也具有很强的感染能力,它是以人类免疫缺陷型病毒HIV-1为基础,进而改造发展而成的基因表达载体。在宿主体内,慢病毒载体将病毒RNA做为模板,合成双链DNA,此后通过环化等一系列反应下,结合病毒整合酶的催化,有效地整合进入到宿主的染色体中,具有遗传特性随着基因组的分裂进而分离,故可以实现目的基因的稳定表达。并且它的感染效率更高,可以容纳大片段外源基因,生物安全性良好。慢病毒以单拷贝的形式将外源基因有效地整合到宿主的染色体中,因此避免了克隆载体重复多拷贝而引起地基因沉默等现象,并且根据筛选基因的不同,可选用其他筛选方式,避免了使用抗生素筛选引起地长期选择过程中的目的基因的丢失,缩短了时间降低了成本。不仅如此,通过包装得到的假病毒颗粒还可以进行反复感染的操作,以增加进入宿主细胞染色体中的外源基因的数目。因此本实验尝试采用慢病毒载体过表达抗CD20抗体2F2,实验结果表明初次感染慢病毒载体后,ELISA检测O0450值时大多为假阳性的细胞株,最高值只有0.149,通过反复感染假病毒后,不仅大幅度的提高了感染效率,减少了假阳性概率,而且ELISA检测OD450值最高可达0.521。由此,我们得出结论：利用慢病毒载体过表达抗CD20抗体2F2,利用假病毒颗粒反复感染CHO细胞,可在一定程度上提高抗CD20抗体2F2在CHO细胞内的表达水平。二.探索应用高通量分选技术对提高抗CD20抗体表达量的影响因为存在“位置效应”和目的基因整合进入宿主细胞基因组中拷贝数的不同,外源基因整合入宿主细胞的基因组后,各个细胞株之间的表达水平存在着显著的差异。有研究表明,在整个混合克隆中仅有少于1%的高表达的细胞克隆株,因此要从上万各细胞中挑选出符合要求的高表达细胞株,工作量繁杂且结果不理想。荧光激活细胞分选器,又称为流式细胞分选仪(flow cytometer, FCM),它是一台集光电测量技术、单克隆抗体技术和电子生物技术为一体的先进检测仪,每秒可分析上万细胞,能够快速地检测细胞的体积、DNA水平、RNA水平、蛋白质表达等化学和物理性质,并且可对需要的细胞株进行分析分选,具有多指标测量、快速检测、多数据大量采集、可对需要的生物颗粒或细胞株分选等特点。依据每个细胞的荧光特征和光散射,流式细胞分选仪从细胞群众将特定的细胞快速分离出来。本实验的设计思路是通过分析细胞内报告蛋白(GFP)表达水平,进而间接分析抗CD20抗体2F2表达量的策略。绿色荧光蛋白(GFP)是一类重要的报告基因,不需要其它酶、底物或辅因子的参与即可自然发光,是一种从水母中分离出来的天然荧光蛋白质。利用双顺反子载体将报告基因与抗CD20抗体体基因共表达,再采用流式细胞分选仪检测荧光强度,分选高表达报告基因的细胞株,从而获得阳性克隆的目的细胞。结果显示,利用流式细胞分选得到的阳性细胞群,再单克隆化操作后ELISA同步检测,OD450最大值为0.819,将传统的有限稀释法作为对照组,对照组O0450最大值仅为0.679,因此,我们得出结论,应用流式细胞分选的方法可以提高抗体表达量。三.控制轻重链比例对CHO细胞表达抗CD20抗体的影响众所周知,抗体是由四条多肽链构成的对称结构,重链(H链)是其中两条相对分子量较大且较长的相同多肽链；而轻链(L链)则是两条相对分子量较小且较短的相同多肽链。抗体重链结合蛋白(BiP)在内质网中与抗体轻链多肽短暂的结合后,轻链可以聚合二聚体的形式分泌到细胞胞外。与抗体轻链组装成四聚体前,抗体重链多肽将与BiP持续保持结合状态,并且在缺乏抗体轻链多肽的前提下,重链最终将无法分泌到细胞胞外,细胞内的蛋白酶体会降解无法分泌到细胞胞外的重链多肽,这样就降低了全抗体的单位生产率。因此,有学者认为过量的轻链多肽对于提高抗体表达量是至关重要的。然而传统的抗体制备过程中,人们将抗体轻重链基因分别克隆在两个相同的质粒载体上,表达抗体蛋白,然而这种方法存在着轻重链比例不可控等缺点。因此,本实验采用内部核糖体进入位点(IRES)将轻重链基因克隆至实验室已构建的高表达载体GC-rich载体上,通过转染G418筛选三周后,利用有限稀释法随机克隆,同时将共转染的载体作为对照组,与对照组进行同步比较,结果显示ELISA同步检测,使用IRES挑取的克隆阳性率为67.7%(65/96),OD450最大值为0.835；虽然对照组的克隆阳性率大致相同为70.8%(68/96),但ELISA同步检测,OD450最大值为0.679；且利用内部核糖体进入位点(IRES)调控轻重链比例所得到的阳性克隆的OD450普遍高于对照组。由此,我们得到以下结论：控制轻重链比例在可提高抗CD20抗体2F2在CHO细胞内的表达水平。