细胞水平的信息传递和调控是研究各种细胞行为的基础，如细胞分裂与增殖、细胞分化以及细胞凋亡等等。本文进行了若干基因调控信息的检测新技术的研究，提出了几种研究DNA结合蛋白以及DNA甲基化定量检测的新方法。 一、DNA与蛋白质之间的相互作用的检测新方法 研究许多细胞调控功能启始于DNA结合蛋白与其相对应的DNA发生特异性的结合，例如转录调节，DNA复制，基因的重组，DNA的错配识别和修复等等。因此，为了更好的研究细胞的功能和基因表达调控的机理，对于DNA结合蛋白的检测以及蛋白结合序列的特征的研究就显得非常重要。 在本文中，研究并发展出两套完整的新型DNA结合蛋白的检测方法： (1)基于外切核酸酶Ⅲ和SYBR-GreenⅠ染料技术的DNA结合蛋白检测方法 在此工作中，发展了一种简单的，便宜的，灵敏的检测技术，用于检测序列特异性的DNA结合蛋白。这项技术采用了Exonuclease Ⅲ(ExoⅢ)足迹和SYBR GreenⅠ(SG)双链DNA染色的方法来检测DNA结合蛋白的结合活性。在这项技术中，设计了与蛋白特异性结合的双链。DNA探针，此双链探针的一端为蛋白的结合位点，另一端具有突出的3’末端(5个突出的胸腺嘧啶T)，用以阻止ExoⅢ从这个方向上的酶切。如果存在被检测的结合蛋白，那么该结合蛋白会特异性的结合到双链：DNA探针的相应结合位点上，从而通过物理上的空间位阻作用，阻止ExoⅢ酶的与探针的结合以及该的切割。这样被保护住的探针就可以在SG荧光染料的作用下产生荧光。反之，没有结合蛋白保护的双链探针将会被ExoⅢ降解，SG因无法与DNA探针结合，则不显示荧光信号。在这项工作中，将此检测方法成功的应用在于核抽提物中检测转录因子NF-κB。同时通过这种技术衡量了NF-κB与不同序列的结合活性。综上，将这种方法命名为ExoⅢ-Dye-based assay，这种技术因其简单，廉价和快速可以被广泛的应用于各种需要检测DNA结合蛋白的生物医学领域。 (2)基于实时定量PcR技术的超灵敏DNA结合蛋白定量检测方法 上一项工作中我们发展了一种简单，廉价和快速的DNA结合蛋白检测方法。但是该方法具有一些局限，如：只具有普通的检测灵敏度(nM级)以及无法精确的定量检测。因此，在进一步的工作中，发展了另一种具有高灵敏度和高定量性的DNA结合蛋白检测技术。这个系统是将ExoⅢ足迹和实时定量PCR扩增技术完善的结合起来，同时该检测过程不同于Immuno PCR，因为其不需要蛋白的特异性抗体的参与。在这项技术中，通过TailedPCR技术制作的双链DNA模版序列，既具有蛋白结合位点(正向序列的5’端)，同时具有特异性扩增的区域。当结合蛋白存在的时候，会结合到此双链DNA模版上的特定区域，从而保护双链DNA的反向序列的3’端不受ExoⅢ的攻击。进而保留下一条完整的单链DNA模版序列用于进行接着的定量PCR扩增。相反，当没有结合蛋白保护的时候，DNA模版的两条链都会受到ExoⅢ的降解，从整个模版都被破坏而无法被定量PCR扩增。此工作中，利用这种检测方法，在Hela细胞核抽提物中检验了10种不同的转录因子。其结果显示该方法具有良好的稳定性和定量效果，且其灵敏度达到fM级。由于这项技术便于使用者自己设计和定制所需检测蛋白的相应探针，并且操作时间和复杂度都不高。因此这种高灵敏度和高定量的检测新技术可以被使用到各种科研，医疗诊断和药物发现中去。 二、基于通用TaqMan技术的DNA甲基化定量检测的新方法研究 真核生物体内的DNA甲基化属于一种DNA修饰作用，是重要的转录水平上的基因调控方式，在细胞分化、发育及增殖过程中起着十分重要的作用。研究表明，肿瘤细胞中基因组总体甲基化水平的降低和某些基因启动子区发生过甲基化是肿瘤最早，也是最常见的分子改变之一。异常：DNA甲基化通常发生在CG密集区，称之为CpG岛，通常位于基因的控制区及第一外显子区。异常DNA甲基化与肿瘤抑制基因的转录失活密切相关，这种现象在肿瘤中非常普遍。因此，异常DNA甲基化的检测可以作为肿瘤诊断和预后的一个有用的分子标记。近年来相关的研究方法发展迅速，本文旨在描述一种基于通用TaqMan技术和OMsP技术的高灵敏、高通量的DNA甲基化分析新分析方法。 该方法结合：MSP及实时定量PCR技术，同时具有MSP的特异性和灵敏性以及实时PCR的快速和抗污染等特性，可对微量DNA的甲基化进行精确定量分析。本文中我们设计和应用了同时具有通用序列、甲基化特异性序列和TaqMan结合区域的引物，利用Tailed PCR技术和定量PCR技术，研究了此通用TaqMan技术应用于QMSP中检测的稳定性和精确性，并对50个相关基因的通用序列进行了设计和试验。结果表明，基于通用TaqMan技术的QMSP检测的方法是一种良好的甲基化检测技术。这种检测方法在具有其特异性特征的同时，大大减少了检测的成本。该方法为进一步的大规模的甲基化检测，寻找出合适的甲基化指标作为肿瘤的分子标志提供了条件和可能性。