背景和目的:肝癌是世界上第六大常见恶性肿瘤，在我国仅次于肺癌位列第二，其死亡率位于恶性肿瘤病死率的第三位，主要原因为大多数患者伴随基础的肝脏疾病，如肝硬化、肝功能代偿失调，手术切除效率低，放疗和化疗的效果差等，所以寻求新的有效的肝癌治疗药物或方法显得尤为重要。利用抑癌基因、肿瘤抑制基因或免疫调节基因等进行的肿瘤靶向治疗是生物基因治疗的重要研究内容，与传统的治疗方法相比，它具有肿瘤特异性，杀伤肿瘤细胞的同时基本不损伤正常组织，被认为是肿瘤治疗中最具前景的治疗方法。但目前的难题在于:病毒基因载体的靶向性较差，尤其是对于较隐蔽的肿瘤微小转移灶或术后复发病灶，载体很难被准确运送到这些部位。基于这些问题，探索安全有效靶向性更好的基因转导系统成为基因治疗研究的重要课题。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类存在于多种组织，具有多向分化潜能的成体干细胞。MSCs具有向炎症、肿瘤部位定向趋化，低免疫原性，易于进行基因改造等优点，已成为基因治疗的理想载体。本研究基于上述理论，探索出一套有效的靶向治疗系统，即利用E1A基因修饰的脐带间充质干细胞(HUMSCs)复制包装出携带由人端粒酶逆转录酶启动子(human telomerase reverse transcriptase promoter, hTERTp)驱动的特异抑瘤基因IL24的腺病毒，通过HUMSCs向肿瘤部位归巢的能力，在肿瘤部位释放出携带此治疗基因的腺病毒颗粒发挥抗肿瘤作用，本课题重点研究这套靶向治疗体系单独或联合5-FU在体内外对HepG2肝癌移植瘤模型的治疗作用。　　方法:利用组织块贴壁法从脐带华通氏胶组织(Whartons Jerry，WJ)中分离培养HUMSCs;流式细胞术分析HUMSCs阳性及阴性的表面标志;利用成骨、成脂诱导体系鉴定HUMSCs的分化潜能。利用PCR、重叠PCR(overlap PCR)、酶切、连接等分子生物学技术构建pGL3-hTERTp报告基因载体及pLentiR.E1A、pAd-hTERTp-IL24、pAd-CMV-Luc慢病毒及腺病毒表达载体，经测序验证其基因序列的正确性。利用293T细胞包装慢病毒颗粒，利用293A细胞包装腺病毒颗粒，并感染HUMSCs确定各自合适的感染复数（multiplicity of infection, MOI）。将pGL3-hTERTp、pGL3-Basic及pGL3-Control三种报告基因载体分别与pRL-TK共转染hTERT阳性的肿瘤细胞及其阴性的MRC-5和HUMSC，利用双荧光素酶的方法鉴定hTERT启动子的转录特异性。利用实时定量PCR的方法分别检测MSC.LentiR+Ad-Track和MSC.LentiR.E1A+Ad-Track中不同时间点的病毒相对拷贝数。体外利用Transwell的方法研究双病毒感染对HUMSCs向HepG2细胞趋化的影响;采用皮下接种的方法建立HepG2肝癌移植瘤模型，尾静脉注射MSC.LentiR+Ad-CMV-Luc或MSC.LentiR.E1A+Ad-CMV-Luc至荷瘤小鼠体内，IVIS成像系统观察其向肿瘤部位的归巢情况。体外采用CCK8细胞增殖抑制实验、细胞凋亡实验及Western blot检测Ad-hTERTp-IL24与低剂量5-FU联用对HepG2肝癌细胞系生长的抑制作用及诱导凋亡的能力。体内，对HepG2肝癌移植瘤模型联合应用MSC.LentiR.E1A+Ad-hTERTp-IL24和低剂量5-FU进行治疗，每3天测量肿瘤直径，根据肿瘤体积计算抑瘤率，评价疗效;治疗结束后取出肿瘤组织，固定后制作石蜡切片，利用免疫组化的方法观察肿瘤组织中MSC的分布及IL24的表达情况;TUNEL的方法检测肿瘤组织中细胞凋亡情况。　　结果:成功从脐带WJ组织中分离培养HUMSCs，鉴定其表面MSCs阳性标志CD73、CD90、CD105均为强阳性，MSCs阴性标志如CD34、CD19、CD45均为阴性，并且可以在体外被诱导分化为脂肪细胞、骨细胞。成功构建载体pGL3-hTERTp、pLentiR.E1A、pAd-CMV-Luc及pAd-hTERTp-IL24，经测序证明其基因序列正确。双荧光素酶的方法验证hTERT启动子在不同的肿瘤细胞中具有较高的转录活性，而在正常细胞如MRC-5及HUMSCs细胞中转录活性极低，说明克隆的hTERT启动子片段具有特异的转录活性。腺病毒Ad-Track及慢病毒LentiR.E1A共同感染HUMSCs后，随着腺病毒早期复制基因E1A逐渐被表达，Ad-Track利用E1A在HUMSCs中启动复制程序，产生更多的腺病毒颗粒，最终将MSC裂解并释放具有感染能力的病毒颗粒。体外，荷载病毒的HUMSCs在LentiR.E1A感染32h之内可以穿过transwell小室向培养HepG2细胞的下室迁移。体内建立BALB/C裸鼠HepG2肝癌移植瘤模型，尾静脉注射MSC.LentiR.E1A+ Ad-CMV-Luc后，第1天迁移并聚集于肿瘤部位;第2天生物发光信号开始减弱直至第4天消失;而在第7天时又在肿瘤部位检测到生物发光信号，为释放的腺病毒颗粒感染肿瘤细胞所致。Ad-hTERTp-IL24具有特异的抑瘤作用，与5-FU联用不仅增强IL24的抗肿瘤作用，还可以通过增加肿瘤细胞摄取腺病毒的方式，达到协同的抗肿瘤作用。体内，经尾静脉注射MSC.LentiR.E1A+Ad-hTERTp-IL24并联合低剂量5-FU对HepG2移植瘤的生长具有明显抑制作用，疗效优于单独治疗。　　结论:本课题首次建立由MSC.LentiR.E1A运载携带肿瘤治疗基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-IL24的双重靶向治疗系统，与5-FU联用可以增强其抗肿瘤作用。该体系为腺病毒载体提供新的给药途径，解决了腺病毒载体缺乏靶向性的问题，并且为肿瘤的微小复发及转移灶的临床治疗提供新的方法和思路。