随着抗肿瘤药物研究的深入,中药及其活性成分在肿瘤治疗及现代医学中的作用日益得到重视。同时临床研究发现,长期给予单一药物治疗癌症的效果常常受到药物敏感性、毒副作用以及耐药性等方面的影响,而临床联合用药方案可以提高疗效、降低毒性,减少耐药性。因此抗肿瘤药物联合用药的相关研究已成为癌症研究领域的新热点。伊利替康(irinotecan,CPT-11)是一种喜树碱类似物,其作为一种半合成的拓扑异构酶抑制剂,可以选择性地抑制拓扑异构酶I,从而干扰DNA的复制,达到抗肿瘤的目的,临床上对于胃肠道肿瘤和其它一些恶性肿瘤具有良好的治疗作用。去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)是中药斑蝥中抗肿瘤活性成分斑蝥素的去甲基衍生物,能在细胞毒性、诱导凋亡、抗粘附转移、抑制肿瘤血管生成等多个环节发挥抗癌作用,是我国自主研发的一种新型低毒的抗癌药物,临床用于治疗胃癌、肝癌、食管及贲门癌等。CPT-11和NCTD均对胃肠道肿瘤有抑制作用,二者作用机制不同。CPT-11作为DNA拓扑异构酶I抑制剂,可以干扰肿瘤细胞DNA的复制以及引起S期阻滞,NCTD可以诱导肿瘤细胞凋亡和G2-M期阻滞。临床上CPT-11可以抑制胃肠道肿瘤的生长,但同时有降低白细胞的毒副作用,而NCTD具有抗肿瘤作用的同时还有显著升高白细胞的作用,因此两者的联合作用值得研究。临床上已有含两种化合物母核结构的抗肿瘤药物联合使用的报道,但缺乏基础研究数据的支持,并且尚未见有CPT-11联合NCTD抗肿瘤临床及基础研究的报道。课题组前期工作及近年研究表明,抑癌蛋白程序性细胞死亡因子4(programmed cell death4,Pdcd4)的表达水平可以影响抗肿瘤药物的抗肿瘤活性,另外,Pdcd4和p53虽同为肿瘤抑制蛋白,两者之间却存在一定负调控关系,而细胞中小mRNA(microRNA,miR)如miR-21对Pdcd4具有重要调节作用。本研究在初步确定CPT-11和NCTD具协同抗肿瘤作用的基础上,进一步分析CPT-11和NCTD单独及协同作用情况下Pdcd4、p53蛋白及miR-21的表达情况,初步探究CPT-11和NCTD联合用药对miR-21-Pdcd4-p53信号通路的调控作用。本研究的主要方法和结果如下:(1)MTT法检测CPT-11及NCTD单独用药和联合用药对人胃癌细胞BGC-823的细胞毒活性,并利用中效原理计算联合用药的联合指数,以此来判断联合用药的作用效应。实验结果表明:CPT-11、NCTD及两药以固定比例(1:1)联用对BGC-823细胞杀伤作用显著,并且作用效果呈一定的时间、浓度依赖性(P<0.05)。与单独用药相比,CPT-11与NCTD联合用药显著提高了对BGC-823细胞的细胞毒活性(P<0.05)。CPT-11与NCTD联合用药在24、48、72h时,主要表现为协同作用,因CPT-11:NCTD(60μM:60μM)作用24h时表现出较强的协同效应,故选用CPT-11 60μM与NCTD 60μM单独及联合用药作用BGC-823细胞24h研究药物对细胞周期、细胞凋亡及miR-21-Pdcd4-p53信号通路的调控作用,以初步探究两药联合的协同作用机制。(2)MTT法考察CPT-11及NCTD联合用药时序贯方式对人胃癌细胞BGC-823的细胞毒活性的影响。实验结果表明:联合用药时序贯方式对细胞抑制的作用有影响,且先用CPT-11方案抑制作用优于先用NCTD方案,在时间点的变化规律上与CPT-11&NCTD单独用药在0、6、12、24h对Pdcd4和p53的调控作用基本一致。(3)流式细胞术考察CPT-11及NCTD单独用药和联合用药以及联合用药序贯方式对人胃癌细胞BGC-823细胞周期的影响。实验结果表明:联合用药可能是通过G2-M期阻滞以及S期的增加,发挥的协同作用。同时联合用药中先用CPT-11方案优于先用NCTD方案可能与G1期的减少,G2-M期以及S期阻滞的增加有关。(4)流式细胞术考察CPT-11及NCTD单独用药和联合用药以及联合用药时序贯方式对人胃癌细胞BGC-823细胞凋亡的影响。实验结果表明:联合用药并不是通过诱导肿瘤细胞凋亡增加而发挥的协同作用。但联合用药中先用CPT-11方案优于先用NCTD方案可能与诱导细胞凋亡增加有关。(5)Westem blot法检测CPT-11及NCTD单独用药对人胃癌BGC-823细胞中Pdcd4及p53表达的影响。实验结果表明:CPT-11及NCTD对人胃癌BGC-823细胞中Pdcd4、p53的调控在时间和浓度上有一定的规律性,两药在调控作用上具有相反的效应,并且药物作用下Pdcd4与p53之间存在一定的负调控关系。(6)Western blot法检测CPT-11及NCTD联合用药对人胃癌BGC-823细胞中Pdcd4及p53表达的影响。实验结果表明:联合用药作用24h对Pdcd4和p53均存在一定程度的上调,说明联合用药可能是通过上调Pdcd4及p53这两种抑癌基因的表达从而发挥了协同效应。由于CPT-11及NCTD单独用药时均在12h后对Pdcd4及p53进行调控,因此联合用药时序贯方式可能会对药物联合作用产生影响。(7)RT-qPCR法检测CPT-11及NCTD单独用药及联合用药对人胃癌BGC-823细胞中miR-21的表达实验结果表明:CPT-11在12、24h抑制miR-21的表达,NCTD在12、24h明显促进miR-21的表达,联合用药组的miR-21表达与对照组相比没有明显变化。由于miR-21对Pdcd4存在一定的负调控作用,因此在时间点的变化规律上与CPT-11&NCTD单独用药在0-24h内对Pdcd4的调控基本吻合。综上所述,CPT-11及NCTD联合用药具有协同作用效应,其机制可能是通过调控miR-21上调表达了 Pdcd4及p53两种肿瘤抑制蛋白,引起细胞G2-M期及S期阻滞的增加。CPT-11及NCTD联用时的序贯方式对细胞抑制的作用有一定影响,先用CPT-11方案要优于先用NCTD方案,其可能与G1期的减少,G2-M期和S期阻滞的增加以及诱导细胞凋亡有关。研究结果可为今后两药联合用于临床抗肿瘤实践提供参考。