背景:重症监护病房获得性肌无力(ICU-acquired muscle weakness,ICUAW)是ICU患者常见的疾病,制动(Immobilization)是导致ICUAW的重要独立危险因素,神经肌肉功能障碍(Neuromuscular dysfunction,NMD)是其中一个主要表现,NMD增加患者肺部感染风险,加重呼吸衰竭,延长机械通气和住院时间。NMD不仅仅在疾病急性期影响到肌肉功能,也可以持续到患者出院后数月甚至一年以上,严重影响患者的生存质量。电针(Elecrtoacupuncture,EA)在临床上对神经肌肉的康复治疗有很好的效果,同时大量研究也证实了穴位电针刺激在治疗骨骼肌萎缩中发挥了保护作用。本课题组前期的研究发现,骨骼肌烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor,n ACh R)异化重构是脓毒症中导致NMD的重要原因,而神经调节蛋白-1(Neuregulin-1,NRG-1)在其中发挥了重要的保护作用。然而截至目前,NRG-1/Erb B介导的n ACh R异化重构在制动导致的NMD中的作用和机制尚未见相关报道,国内外也尚缺乏EA是否通过NRG-1/Erb B信号通路干预NMD的相关研究。本研究将为制动导致的NMD提供新的治疗思路和靶点。目的:研究制动情况下大鼠骨骼肌是否会发生n ACh R异化重构现象,探讨制动不同时间点n ACh R异化重构和NMD以及NRG-1的关系。其次,我们将通过干预NRG-1/Erb B的变化探讨制动是否通过NRG-1/Erb B介导的n ACh R异化重构导致NMD,明确其机制,以期望为制动导致的NMD提供新的治疗靶点和策略。最后,观察NRG-1/Erb B介导的n ACh R异化重构是否在EA干预NMD中发挥作用,明确EA是否通过NRG-1/Erb B改善制动大鼠神经肌肉功能障碍。方法:本研究分为三部分第一部分选取健康成年雄性Sprague–Dawley(SD)大鼠,鼠龄2~3月,体重220~250 g。采用随机数字表法随机分成两组:假手术组(Sham)和制动组(Immobilization)。根据建模时间的不同,各组再分为四个亚组,即第1天组(Day 1),第3天组(Day 3),第7天组(Day 7)以及第14天组(Day 14)。分别于各个时间点进行指标检测和标本采集。观察不同时间点假手术组和制动组大鼠的活动情况,采用苏木精伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,H&E)观察各个时间点大鼠胫前肌细胞萎缩程度,计算其肌纤维直径(Muscle fiber size)和肌细胞横截面积(Cross-sectional area,CSA);测量各个时间点大鼠体重和胫前肌湿重;检测各组大鼠胫前肌复合肌动作电位(compound muscle action potential,CMAP)并测定其幅值(Amplitude)和持续时间(Duration),测定潜伏期(latency time)并计算神经传导速度(Nerve conduction velocity,NCV);取大鼠胫前肌组织,利用免疫荧光法检测ε-n ACh R,γ-n ACh R和α7-n ACh R三种受体在骨骼肌细胞膜上的表达情况;利用western-blot法检测不同时间点三种n ACh R和第14天NRG-1的蛋白表达情况。第二部分实验一:建立大鼠制动模型后,通过腹腔内注射不同剂量的人重组神经调节蛋白1(Recombinant human neuregulin-1,rh NRG-1),分别为0μg/kg/d、1μg/kg/d、10μg/kg/d、20μg/kg/d、50μg/kg/d,14天后通过大鼠行为学,骨骼肌形态学分析以及胫前肌CMAP筛选出改善制动大鼠神经肌肉功能的rh NRG-1最适剂量。实验二:建立大鼠制动模型后,通过腹腔内注射rh NRG-1和(或)Erb B受体抑制剂PD-158780调节NRG-1/Erb B信号通路的变化,明确制动导致NMD的机制。将制动大鼠随机分为四组:制动组[rh NRG-1(-)PD-158780(-)];制动+rh NRG-1组[rh NRG-1(+)PD-158780(-)];制动+PD-158780组[rh NRG-1(-)PD-158780(+)];制动+rh NRG-1+PD-158780组[rh NRG-1(+)PD-158780(+)],各组均在建模后14天检测制动大鼠胫前肌CMAP反应其神经肌肉功能;采用免疫荧光法检测ε-n ACh R,γ-n ACh R和α7-n ACh R三种受体在骨骼肌细胞膜上的表达情况;Western-blot检测三种Erb B受体Erb B2、Erb B3、Erb B4及其磷酸化水平,以及下游重要信号分子P-Erk1/2、Erk1/2、GABPα、GABPβ的变化情况。第三部分实验一:探讨EA对制动大鼠NMD的影响。选用鼠龄在2~3个月的健康成年雄性SD大鼠建立制动模型,首先将大鼠分为正常组(Control),假手术组(Sham),制动组(Immobilization),制动+穴位电针刺激组(EA)。实验二:验证非穴位电针刺激对NMD和n ACh R异化重构的影响。SD成年雄性大鼠随机分为三组,制动组(Immobilization),制动+穴位电针刺激组(EA)和制动+非穴位电针刺激组(NEA)。EA组利用一定频率和强度的电针对大鼠制动后肢的足三里(ST36)和环跳穴(GB30)进行刺激,NEA组选择掌骨尺骨侧进行刺激。实验一和实验二均在建模后14天进行标本采集和相关指标检测。分别采用H&E染色观察不同组别大鼠胫前肌的萎缩情况;测量大鼠体重胫前肌的湿重;检测各组大鼠胫前肌CMAP水平,测量其幅值,持续时间,潜伏期和神经传导速度。通过主成分分析(Principal component analysis,PCA)和聚类分析(Hierarchical cluster analysis,HCA)分析各组大鼠神经肌肉功能;利用western-blot和免疫荧光检测胫前肌三种n ACh R的表达水平,western-blot检测胫前肌NRG-1、三种Erb B受体Erb B2、Erb B3、Erb B4,以及下游信号Erk1/2及其磷酸化水平、GABPα、GABPβ的蛋白表达。实验三:为进一步验证NRG-1/Erb B信号通路在EA干预制动导致的NMD中的作用,通过给予EA和(或)腹腔内注射Erb B受体特异性抑制剂PD-158780,将制动大鼠随机分为四组,分别为制动组[EA(-)PD-158780(-)];制动+EA组[EA(+)PD-158780(-)];制动+PD-158780组[EA(-)PD-158780(+)];制动+EA+PD-158780组[EA(+)PD-158780(+)],建模14天后进行相关指标检测和标本采集。检测制动大鼠胫前肌CMAP反应其神经肌肉功能;采用免疫荧光法检测ε-n ACh R,γ-n ACh R和α7-n ACh R三种受体在骨骼肌细胞膜上的表达情况;通过 western-blot检测NRG-1、三种Erb B受体Erb B2、Erb B3、Erb B4及其磷酸化水平,以及下游重要信号分子P-Erk1/2、Erk1/2、GABPα、GABPβ和三种n ACh Rs的变化情况。结果第一部分(1)Sham组大鼠水平移动距离和直立次数随时间延长逐渐增加,而Immobilization组大鼠各时间点的水平移动距离和直立次数逐渐减小(P<0.05)。与Sham组比较,Immobilization组大鼠Day1,Day 3、Day 7以及Day 14各时间点水平移动距离和直立次数均减少,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)通过胫前肌H&E染色发现,随着制动时间的延长,肌细胞萎缩更严重,肌纤维间隙增宽。Sham组各时间点肌细胞横截面积(CSA)和肌纤维直径比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Immobilization组胫前肌CSA和肌纤维直径在各时间点比较,差异有统计学意义(P<0.05)。制动情况下Day 3、Day 7以及Day 14各时间点肌细胞横截面积和肌纤维直径,与Sham组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。随着制动时间的延长,肌肉萎缩越明显,制动Day14组胫前肌萎缩最严重。(3)通过对大鼠体重和胫前肌重量测量后发现,建模期间Immobilization组和Sham组大鼠体重相比,差异无统计学意义(P>0.05)。Immobilization组各时间点的胫前肌重量以及胫前肌体重比值比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与Sham组比较,Immobilization组Day 3、Day 7以及Day 14各时间点的大鼠胫前肌重量和胫前肌体重比值均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)Immobilization组各时间点的CMAP各指标,包括幅值、持续时间、潜伏期和神经传导速度比较,差异有统计学意义(P<0.05)。随着制动时间的增加,其CMAP幅值降低,持续时间延长,潜伏期延长而神经传导速度降低。Sham组各时间点CMAP幅值、持续时间、潜伏期和神经传导速度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Immobilization组和Sham组在建模后同一时间组CMAP各指标比较,差异有统计学意义(P<0.05)。(5)免疫荧光染色结果显示,三种n ACh R均分布于骨骼肌细胞膜上。与Sham组比较,Immobilization组Day 1、Day 3、Day 7以及Day 14各时间点的大鼠胫前肌细胞膜上α7-n ACh R和γ-n ACh R表达水平逐渐增高;而正常受体ε-n ACh R表达逐渐降低,在建模后14天,α7-n ACh R和γ-n ACh R表达最高,ε-n ACh R表达最低,差异有统计学意义(P<0.05)。western-blot检测结果提示,α7-n ACh R,γ-n ACh R和ε-n ACh R蛋白表达变化和免疫荧光结果趋势一致。(6)与Sham组比较,制动Day 14组的大鼠胫前肌的neuregulin-1蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分(1)大鼠行为学和胫前肌H&E结果提示,外源性给予rh NRG-1使制动大鼠水平活动距离和直立次数增加,并减轻其胫前肌肌肉萎缩。(2)通过CMAP结果提示,随着外源性给予rh NRG-1剂量的增加,其大鼠CMAP各指标恢复程度越好,说明其神经肌肉功能恢复更好。腹腔内给予20μg/kg/d和50μg/kg/d rh NRG-1时,其反应神经肌肉功能的CMAP各参数差异无统计学意义(P>0.05),因此我们认为腹腔内给予20μg/kg/d rh NRG-1可能是改善制动大鼠神经肌肉功能障碍的最合适剂量。(3)免疫荧光结果提示,与制动组[rh NRG-1(-)PD-158780(-)]比较,制动+rh NRG-1组[rh NRG-1(+)PD-158780(-)]胫前肌细胞膜上α7-n ACh R和γ-n ACh R表达水平降低,ε-n ACh R水平表达增加(P<0.05),而制动+PD-158780组[rh NRG-1(-)PD-158780(+)]、制动+rh NRG-1+PD-158780组[rh NRG-1(+)PD-158780(+)]的胫前肌ε-n ACh R表达降低,α7-n ACh R和γ-n ACh R表达水平增高,差异有统计学意义(P<0.05),其结果与western-blot结果趋势相一致。(4)通过western-blot检测后发现,与制动组[rh NRG-1(-)PD-158780(-)]比较,制动+rh NRG-1组[rh NRG-1(+)PD-158780(-)]的胫前肌中P-Erb B2、P-Erb B3、P-Erb B4以及P-Erk1/2表达水平增高,GABPα、GABPβ表达增高(P<0.05),而制动+PD-158780组[rh NRG-1(-)PD-158780(+)]、制动+rh NRG-1+PD-158780组[rh NRG-1(+)PD-158780(+)]的胫前肌中P-Erb B2、P-Erb B3、P-Erb B4以及P-Erk1/2表达水平降低,GABPα、GABPβ表达降低(P<0.05)。第三部分(1)与Immobilization组比较,EA组胫前肌横截面积和肌纤维直径均增加,差异有统计学意义(P<0.05);Control组与Sham组比较,两组差异无统计学意义(P>0.05);Immobilization组与NEA组比较,两组差异无统计学意义(P>0.05)。(2)胫前肌重量和胫前肌体重比值,Control组与Sham组比较,两组差异无统计学意义(P>0.05);Immobilization组与NEA组比较,两组差异无统计学意义(P>0.05);与Immobilization组比较,EA组胫前肌重量和胫前肌体重比值均增加,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)CMAP结果提示:与Sham组比较,Immobilization组CMAP幅值降低、持续时间延长、肌颤搐收缩力降低和神经传导速度降低,差异有统计学意义(P<0.05);与Immobilization组相比,EA组CMAP幅值增加、持续时间缩短、肌颤搐收缩力增加和神经传导速度增加,差异有统计学意义(P<0.05);Immobilization组与NEA组比较,两组差异无统计学意义(P>0.05);Control组与Sham组比较,两组差异无统计学意义(P>0.05)。(4)根据CMAP数据结果,我们对其幅值、持续时间、肌颤搐收缩力和神经传导速度数据做了主成分分析(PCA)和聚类分析(HCA)。PCA和HCA结果提示:Control组与Sham组大鼠神经肌肉功能无明显差异,Immobilization组与Control组和Sham组两组距离最远,提示其神经肌肉功能越差。EA组大鼠神经肌肉功能得到改善,其与Control组和Sham组距离缩短。(5)免疫荧光染色结果提示,与Sham组比较,Immobilization组骨骼肌细胞膜上α7-n ACh R和γ-n ACh R表达显著增加,而正常受体ε-n ACh R表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);与Immobilization组比较,EA组骨骼肌细胞膜上α7-n ACh R和γ-n ACh R表达水平降低;而正常受体ε-n ACh R表达增高,差异有统计学意义(P<0.05);NEA组与Immobilization组比较,两组差异无统计学意义(P>0.05);western-blot检测结果提示,ε-n ACh R,α7-n ACh R和γ-n ACh R蛋白表达变化和免疫荧光结果趋势一致。(6)western-blot结果提示,与Sham组比较,Immobilization组胫前肌NRG-1、Erb B2、Erb B3、Erb B4蛋白表达减少,Erk1/2磷酸化水平降低,GABPα、GABPβ表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);与Immobilization组比较,EA组胫前肌NRG-1、Erb B2、Erb B3、Erb B4蛋白表达增高,Erk1/2磷酸化水平增高,GABPα、GABPβ表达增高,差异有统计学意义(P<0.05);(7)CMAP结果提示,与制动组[EA(-)PD-158780(-)]比较,制动+电针组[EA(+)PD-158780(-)]幅值增加,潜伏期缩短,持续时间缩短,神经传导速度增加,具有显著性差异(P<0.05);制动+PD-158780组[EA(-)PD-158780(+)]和制动+电针+PD-158780组[EA(+)PD-158780(+)]幅值降低,潜伏期延长,持续时间延长,神经传导速度降低,具有显著性差异(P<0.05)。(8)免疫荧光显示,与制动组[EA(-)PD-158780(-)]比较,制动+电针组EA(+)PD-158780(-)胫前肌细胞膜上ε-n ACh R表达增加,α7-n ACh R和γ-n ACh R表达水平降低(P<0.05),而制动+PD-158780组[EA(-)PD-158780(+)]和制动+电针+PD-158780组[EA(+)PD-158780(+)]胫前肌α7-n ACh R和γ-n ACh R表达水平增加,ε-n ACh R表达降低,具有显著性差异(P<0.05),与western-blot结果趋势一致。(9)Western-blot结果提示,与制动组[EA(-)PD-158780(-)]比较,制动+电针组EA(+)PD-158780(-)胫前肌中NRG-1、Erb B2、Erb B3、Erb B4以及Erk1/2磷酸化水平增高,GABPα、GABPβ表达增高(P<0.05),而制动+PD-158780组[EA(-)PD-158780(+)]和制动+电针+PD-158780组[EA(+)PD-158780(+)]中NRG-1、Erb B2、Erb B3、Erb B4以及Erk1/2磷酸化水平降低,GABPα、GABPβ水平表达降低(P<0.05)。结论(1)制动导致的骨骼肌肌肉萎缩和NMD,与NRG-1的表达降低和骨骼肌n ACh R异化重构有关;(2)制动通过NRG-1/Erb B信号通路介导的n ACh R异化重构导致NMD,外源性给予rh NRG-1可减轻大鼠骨骼肌肌肉萎缩,通过NRG-1/Erb B信号通路抑制n ACh R异化重构,改善制动导致的NMD,为制动导致的NMD提供了新的治疗靶点和方法;(3)穴位电针刺激可上调NRG-1的表达,减轻骨骼肌肌肉萎缩,通过NRG-1/Erb B信号通路抑制n ACh R异化重构,改善制动导致的神经肌肉功能障碍。