狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的以中枢神经系统感染为特征的人畜共患传染病,人和动物一旦发病死亡率几乎达100%(WHO 2009)。全世界每年因狂犬病死亡的人数超过55000人,我国是狂犬病高发国家之一。目前狂犬病尚无特效的治疗方法或药物,疫苗的预防接种是该病防控的重要手段。本研究通过反向遗传操作技术在狂犬病病毒疫苗株LBNSE基因组中插入鼠源FMS样酪氨酸激酶3配体(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand,Flt3L)基因,构建了重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L。ELISA检测结果表明重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L可在感染的BSR细胞表达Flt3L且具有剂量依赖性。LBNSE-Flt3L在体外生长曲线与亲本毒株几乎一致,表明外源基因Flt3L的表达对病毒的复制与扩散没有影响。脑部攻毒实验发现小鼠并无发病症状,其体重呈先下降后上升的趋势,较亲本毒株LBNSE对小鼠致病性减弱,但差异不显著。为进一步研究LBNSE-Flt3L的免疫原性,将重组狂犬病病毒免疫小鼠,与亲本病毒LBNSE进行比较,并将实验室之前构建的LBNSE-GM-CSF(Wen et al 2011)作为阳性对照。在免疫后第1-10周每周采血检测其体内的中和抗体水平,发现LBNSE-Flt3L和LBNSE-GM-CSF诱导的抗体水平在第四周均达到最高值,与亲本毒株LBNSE相比,LBNSE-Flt3L与LBNSE-GM-CSF相似,均能更快地诱导机体产生更高滴度的抗体。另外,在重组狂犬病病毒免疫后的第二周,对免疫小鼠进行了攻毒实验,脑内注射50LD50的CVS-24病毒,结果发现LBNSE-Flt3L的免疫保护率可达到80%,而LBNSE的免疫保护率则为45%。为进一步研究细胞因子Flt3L增强狂犬病病毒免疫原性的作用机制,我们分离了小鼠骨髓源树突状细胞(DC),并感染LBNSE-Flt3L,利用流式细胞仪检测了重组病毒LBNSE-Flt3L对树突状细胞(DC)的激活作用;同时,还将LBNSE-Flt3L感染6周龄小鼠,同样利用流式细胞术对其感染后DC的激活以及对生发中心(Germinal Center,GC)的B细胞的的促进情况进行分析。结果发现无论是体外还是体内实验,与Mock组和亲本毒株LBNSE相比,LBNSE-Flt3L均可以显著激活DC,与LBNSE-GM-CSF效果相当,并能促进更多GC B细胞的生成。总之,表达Flt3L的重组狂犬病病毒LBNSE-Flt3L可以通过激活DC和促进GC B细胞的生成来增强免疫原性,提高抗病毒中和抗体的水平,从而提高了免疫保护率。本研究将为新型狂犬病疫苗的研究奠定了基础。