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[目 的]本课题拟从临床水平明确miR-642a-5p与UC糖皮质激素应答的相关性;动物水平观察miR-642a-5p在DSS结肠炎建模小鼠中的疗效;细胞水平揭示miR-642a-5p通过TLR4信号通路参与糖皮质激素抵抗的作用机制。旨在阐明miR-642a-5p调控GC应答的作用机制,为GC抵抗型UC提供新治疗靶点的理论依据。[方法]本课题分为三部分:一、临床实验分别入组糖皮质激素敏感的患者20例,糖皮质激素抵抗的患者20例,收集使用糖皮质激素治疗前的肠粘膜标本。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)miR-642a-5p 与 TLR4 及炎症因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-12 mRNA 水平,以明确miR-642a-5p与糖皮质激素抵抗型UC的相关性。二、动物实验(1)DSS小鼠模型构建以及miR-642a-5p前体和抑制的慢病毒干预:选择140只BALB/C小鼠,体重20-25g,随机分为正常对照组(control)、DSS 组、pre-miR-642a-5p 组、miR-642a-5p-inhibitor 组、Dex 组、Dex+pre-miR-642a-5p 组、Dex+miR-642a-5p-inhibitor 组。正常喂养作为对照组,而实验组的小鼠则予3%DSS溶液造模,连续7天,第8天分别给与静脉注射慢病毒或/及腹腔注射地塞米松后,第15天处死小鼠获取结肠标本。(2)评估DAI、结肠损伤评分及结肠黏膜组织病理学评分。(3)PCR检测各组结肠黏膜中miR-642a-5p及TLR4、炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12 mRNA 的表达水平。(4)Western Blot检测NF-Kb亚型在核内外的分布情况。(5)免疫荧光染色检测NF-κb及GR的表达情况。三、细胞实验(1)miR-642a-5p mimics转染细胞后检测各组细胞中关键蛋白及炎症因子的表达水平。设计合成 miR-642a-5p mimics;将 THP-1 共分为 6 组:Control+miR-NC 组、LPS+miR-NC 组、DEX+LPS+miR-NC 组、Control+miR-642a-5p mimics 组、LPS+miR-642a-5p mimics 组及 DEX+LPS+miR-642a-5p mimic 组。qRT-PCR 检测miR-642a-5p 及 TLR4、炎症因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12mRNA 的表达水平;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;MTT法检测细胞存活率;ELISA检测培养基上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等炎症因子的变化情况;免疫荧光检测GR、NF-κb p65 的入核情况;Western Blot 检测 TLR4-MyD88-TAK1/p38/JNK 信号通路表达相关蛋白的表达变化。(2)明确TLR4是否为miR-642a-5p的靶基因:通过LPS、不同TLR激活剂、DEX和TGFβ(TLR信号通路的负调节因子)处理THP-1细胞,明确miR-642a-5p是否与TLR4信号通路相关;荧光素酶报告检测TLR4与miR-642a-5p是否具有结合位点;构建TLR4过表达质粒,miR-642a-5p mimics转染细胞后明确是否能抑制TLR4过表达细胞株的炎症反应。[结 果]临床实验:在糖皮质激素敏感(GCS)和糖皮质激素抵抗(GCR)两组患者中,与GCS组患者的结肠粘膜样本相比,GCR组miR-642a-5p表达显著降低,TLR4表达水平升高,而其他因子炎症因子IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α均相应升高。动物实验:(1)与control组相比,DSS造模组与各实验组DAI评分、结肠损伤评分、组织病理学评分均有所增高;与DSS造模组相比,Dex组、Dex+pre-miR-642a-5p组、Dex+miR-642a-5p inhibitor组DAI评分、结肠损伤评分、组织病理学评分明显下降,其中以Dex+pre-miR-642a-5p组下降最明显。(2)qRT-PCR检测结果发现,与DSS组相比,pre-miR-642a-5p组肠粘膜中 miR-642a-5p 表达升高,miR-642a-5p inhibitor 组 miR-642a-5p 表达下调,差异有统计学意义(P<0.05),提示慢病毒转染后在肠粘膜发挥作用。同时,炎症因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12 及 TLR4 mRNA 与 miR-642a-5p 的表达呈负相关;Dex还与pre-miR-642a-5p共同增强了对TLR4转录水平的抑制作用及抗炎作用。(3)Western Blot 检测结果发现,与 DSS 组相比,pre-miR-642a-5p 组 NF-κb p65及p50的在细胞质中的表达较高,miR-642a-5p inhibitor组p65及p50的表达较低。反之,pre-miR-642a-5p组p65及p50在细胞核中的表达下调,miR-642a-5p inhibitor组p65及p50的表达较高,差异有统计学意义(P<0.05)。同时发现,与 miR-642a-5p inhibitor 组相比,Dex+pre-miR-642a-5p 组 NF-κb p65 及 p50 在细胞质中的表达较高,在细胞核中的表达较低,差异有统计学意义(P<0.05),提示miR-642a-5p有协同Dex抑制NF-κb入核,达到增强抗炎的作用。(4)免疫荧光染色发现,与 miR-642a-5p inhibitor 组相比,pre-miR-642a-5p组NF-Kbp65及p50的表达下调,差异有统计学意义(P<0.05)。另外,与Dex组及 miR-642a-5p inhibitor 组相比,Dex+pre-miR-642a-5p 组 GR 的表达较高,差异有统计学意义(P<0.05),提示miR-642a-5p通过协同Dex提高GR的表达水平,达到抗炎的作用。细胞实验:(1)将THP-1用miR-642a-5p mimics转染后,通过MTT检测及流式细胞仪检测细胞生存能力。结果显示24h和48h时,与空白对照组或者miR-NC对照组相比,miR-642a-5p mimics转染组的细胞活力及死亡率无明显差异,说明miR-642a-5p对THP-1活力及死亡率无影响。(2)miR-642a-5pmimics单独转染THP-1对于LPS诱导的促炎作用无明显影响;而miR-642a-5p mimics转染细胞后,能够协同DEX降低LPS诱导的炎症因子 IL-12、IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。(3)Western Blot及免疫荧光验证了 GR及NF-κb亚型表达水平变化,结果显示:miR-642a-5pmimics、LPS和DEX处理后,细胞质中GR的表达均无显著的变化,但LPS能够增加NF-Kb p65和NF-κb p50的入核表达;而DEX能够维持二者的胞质表达。miR-642a-5p mimics及Dex处理细胞后,增加了 GR的细胞核内表达水平及NF-Kb p65和p50的胞质表达水平。(4)采用不同TLR激活剂处理细胞,结果显示在TLR2激动剂pam3CSK4、TLR3 激动剂 poly(I:C)、TLR7 激动剂 imiquimod、TLR9 激动剂 CpG oligodeoxynucleotide(CpGDNA oligo)对 miR-642a-5p 的表达水平均无变化。LPS可以下调miR-642a-5p的表达,DEX和TGFβ能够上调miR-642a-5p的表达,结果有统计学意义(P<0.05)。这暗示了 miR-642a-5p可能通过TLR4发挥作用。(5)生物信息学分析及荧光素酶报告明确TLR4是miR-642a-5p的靶基因。另外,将miR-642a-5p mimics转染至细胞中,能够降低TLR4 mRNA的表达水平。miR-642a-5p能够加强LPS诱导下DEX对于TLR4的抑制作用,抑制TLR4在细胞表面的表达。与野生型细胞相比,在TLR4过表达细胞中炎症因子水平呈现高水平,而DEX并未降低炎性因子的水平;而采用miR-642a-5p mimics转染细胞后,炎性因子水平有所降低(P<0.05)。(6)LPS能够诱导上调TLR4、MyD88、TAK1等因子的表达,并增加ERK、p38和JNK的磷酸化水平,DEX能够抑制其磷酸化,而miR-642a-5p mimics预处理细胞后,能够进一步抑制磷酸化水平。[结 论]1、与糖皮质激素敏感型相比,miR-642a-5p在糖皮质激素抵抗型UC肠粘膜中表达下调,而IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α等炎症因子及TLR4表达增加,与miR-642a-5p的表达水平呈负相关。2、小鼠体内证实miR-642a-5p与IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α等炎症因子及TLR4 mRNA的表达水平呈负相关关系。3、体内、体外实验表明,过表达miR-642a-5p后可以协同糖皮质激素的抗炎作用,降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12的分泌水平,阻遏NF-κb p65及p50转入细胞核内,并且促进GR的表达,提高糖皮质激素的敏感性。4、体外实验发现,miR-642a-5p可通过靶向抑制TLR4,从而可以影响LPS诱导的TLR4/MyD88/TAK1信号通路的表达,下调ERK、p38和JNK的磷酸化水平,减少NF-κb的表达及入核,促进糖皮质激素受体入核发挥抗炎作用,从而起到协同糖皮质激素抑制炎症的作用。