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猪圆环病毒(Porcine Circovirus,PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae),其基因组为单股环状DNA,病毒粒子无囊膜,呈二十面体对称,是目前已知的最小病毒之一。PCV有Ⅰ型(PCV1)和Ⅱ型(PCV2)两种基因型,PCV1首先由Tischer于PK-15细胞中发现,基因组全长1759bp,无致病变性;PCV2基因组长1767bp或1768bp,被认为是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)的主要病原。 本研究通过PCR扩增,从河南某猪场送检的疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征的病猪腹股沟淋巴结中检测到了猪Ⅱ型圆环病毒(Porcine Circovirus Type 2,PCV2)核酸,将病料研磨、过滤除菌后接种无PCV1和PCV2污染的PK-15细胞,盲传12代后用PCR方法仍然能够在接种细胞中检测到PCV2核酸。从接毒细胞中收获病毒经超速离心纯化,负染后电镜观察,可见直径约17nm,呈二十面体对称结构的病毒粒子,将该毒株命名为PCV2 HeNan株(GenBank登陆号:AY969004)。序列分析表明:该株病毒全基因组长1767bp,包含11个开放读码框,与PCV1的核苷酸同源性介于76.2%-77.3%,与其他PCV2株的同源性介于95.5%-99.6%。 根据GenBank中发表的猪圆环病毒的核苷酸序列,设计3对特异性引物。通过PCR方法,以引物P1和P2从接毒细胞中扩增到猪Ⅱ型圆环病毒全基因组,克隆入pBluescript Ⅱ SK(+)载体构建质粒SK-PCV2,以其为模板用引物P5和P6扩增其不包含PCV2-ORF2的部分基因(SK-PCV2△ORF2);另一对引物P3、P4用于特异性扩增猪Ⅰ型圆环病毒(PCV1)的ORF2基因,与前面得到的SK-PCV2△ORF2基因连接,构建嵌合型质粒SK-PCV2-1,以此为基础构建双联体质粒SK-PCV2-1(DB)。体外转染PK-15细胞,盲传四代后,用RT-PCR和间接免疫荧光方法检测,结果表明本实验构建的嵌合病毒PCV2-1克隆具有感染性。 本研究成功地从患PMWS病猪腹股沟淋巴结中分离到一株PCV2病毒,克隆了病毒的全基因组并测序。通过系统发育进化分析表明,不同PCV分离株在进化上存在明显的地域相关性,在此基础上构建了嵌合病毒PCV2-1的感染性分子克隆。这些工作为研究PCV2的流行和变异,探索PCV2的致病机理、遗传进化等研究提供了材料,同时也为研制新型疫苗奠定理论基础。