扎伊尔型埃博拉病毒(Zaire ebolavirus,EBOV)能在人类和非人灵长类(nonhuman primates,NHPs)体内引发急性严重出血热病,具有极强的传染性和致死率。2014年西非爆发的埃博拉疫情推进了相关疫苗和抗病毒药物的快速发展,但截止目前仍没有获批的预防或治疗埃博拉病毒的药物。埃博拉病毒的包膜糖蛋白(glycoprotein,GP)在病毒入侵过程中扮演着关键的角色,是疫苗和抗体研究的重要靶标。实验室前期自主研制的5型腺病毒载体的重组埃博拉疫苗已完成了II期临床试验,在人体中具有良好的安全性,并且可有效地激发免疫反应。由于疫苗需要在感染前使用才能达到保护效果,所以开展暴露后治疗手段的研究很有必要,而单克隆抗体因其良好的特异性和药代动力学特点,是目前免疫治疗的研究热点。本研究的目的是从疫苗临床受试者体内筛选具有埃博拉病毒中和活性的单克隆抗体,并对其结合表位和保护机制进行研究,为埃博拉病毒的暴露后治疗提供有效的手段。首先,基于流式分选和单细胞PCR的抗体筛选平台,从疫苗受试者血样中筛选获得了GP的结合抗体。利用人类免疫缺陷病毒骨架的重组EBOV假病毒对不同受试者的血清进行体外中和实验,细胞感染的程度通过荧光素酶报告基因的表达水平来反映。各血清样品对假病毒表现出不同程度的中和活性,选取中和活性较好的受试者血样进行了流式分选。根据选定的表面分子标记策略,从外周血淋巴细胞中分离得到1920个抗体分泌细胞。然后通过单细胞反转录和巢式两步PCR的方法,从单个抗体分泌细胞中扩增并挑选出462对自然配对的抗体轻重链可变区基因,阳性率为24%。为了快速、高通量地表达抗体,将配对的抗体轻重链可变区基因分别构建成轻重链全长基因线性表达框,转染至HEK293T细胞。ELISA检测细胞培养上清中的IgG含量及GP的结合活性,筛选得到32株GP结合阳性的抗体,得率为6.93%。对结合抗体基因的同源性分析显示这些抗体两两不同,其亚类分布与正常人体内抗体的亚类分布一致。其次,制备了四种截短型抗原,对纯化抗体的结合特性进行进一步的分析。将抗体轻重链基因构建至pcDNA3.4质粒中,并在Expi293细胞中表达,经Protein A亲和纯化,成功获得了纯化的单克隆抗体。为了分析单抗的结合区域,设计构建了四种截短型的GP——GPecto、GPdmucin、sGP和GP1。选择分子量适中、在整个实验设计中最为重要的GPdmucin,分别在原核、昆虫和哺乳动物细胞中进行了表达和鉴定,以确定最佳的表达系统。结果显示,原核系统表达的GPdmucin不稳定,活性差;在昆虫表达系统中,不溶性的GPdmucin表达在细胞内;利用Expi293瞬时蛋白表达系统,得到了可溶表达的GPdmucin,Ni柱亲和层析获得的目的蛋白纯度达90%以上,且与特异抗体具有良好的结合活性。随后对另外三种截短型的GP进行了表达和纯化。用以上抗原对纯化单抗进行了特异性及结合区域分析,17株单抗特异性良好,其中16株抗体能与四种截短型GP均发生结合,说明这些抗体结合于四种截短型GP所共有的sGP区域;1株抗体17F3仅能与GPecto和GPdmucin结合,不能与sGP和GP1结合,推测其结合于GP2亚基。再次,在体外和体内对单抗的中和活性进行了评价。采用HIV-EBOV GP和VSV-EBOV GP假病毒分别在HEK293和Vero细胞上进行了中和实验,一株抗体1B3对两种假病毒均表现出较好的中和能力。在加拿大公共卫生局国家微生物实验室中进行的动物保护实验结果显示,感染EBOV后第1天和第2天单独给药,1B3抗体可分别提供90%和60%的存活率,起到显著的保护作用。1B3对EBOV良好的中和活性提示其是一株潜在的EBOV治疗抗体。丝状病毒的GP之间有着较高的序列同源性和结构相似性,尤其是受体结合区更为保守,而1B3可能与保守性的受体结合区存在作用,用多种丝状病毒的GP对1B3的广谱结合活性进行了分析,结果显示1B3能够与BDBV GP交叉结合,但体外不能中和BDBV假病毒,说明1B3在BDBV上的结合方式不同于EBOV。最后,我们对1B3抗体的结合表位与中和机制进行了研究。通过计算机软件Discovery Studio,对1B3和GP的结合方式进行了预测分析,得到两者结合的关键氨基酸位点。构建GP关键位点的丙氨酸突变株,利用pDisplay载体将其展示在细胞表面,通过Western Blot和流式分析进行了验证。得到GP上的关键氨基酸为位于受体结合区两端的117和118、171和172两对相邻的氨基酸,这些位点突变后GP与1B3的结合活性丢失。这四位氨基酸在丝状病毒的受体结合区上是保守的,通过构建突变株排除了该区域其他非保守氨基酸参与1B3结合的可能。但结合于sGP区域的1B3不能与除了BDBV、EBOV以外的GP结合,提示聚糖帽上的一些位点可能参与了1B3的结合。借助已知结合表位的MIL77-1/-2/-3抗体,通过竞争结合实验对1B3的表位进行了分析。1B3与结合于聚糖帽的MIL77-3抗体竞争结合GP,说明二者的表位空间接近或存在交叠。为了研究1B3的保护机制,用嗜热菌蛋白酶(thermolysin)体外酶切GPdmucin,切掉其上的聚糖帽,制备了激活态的GP(primed GP,GPcl)。同时,分别在原核与哺乳动物系统中表达,制备了NPC1受体C结构域蛋白(NPC1 Domain C,NPC1-C)。受体结合抑制实验结果显示,1B3对GPcl与NPC1-C的结合并未呈现出浓度依赖的抑制作用,说明1B3不是通过阻断GPcl与NPC1-C结合发挥保护作用的。进一步研究发现1B3与GPcl的结合活性丢失,说明聚糖帽对于1B3与GP的结合密切相关,以上实验说明1B3可能通过与受体结合区117、118、171和172位关键氨基酸及聚糖帽某些位点或糖基共同形成的表位作用发挥保护活性。在酶切阻断实验中,饱和结合1B3的GPdmucin仍可被thermolysin正常酶切,提示1B3不是通过阻断酶切来发挥保护活性。综上所述,本研究从重组埃博拉疫苗临床受试者体内筛选获得了多株GP特异的抗体,大部分的抗体结合于sGP区域;在哺乳动物表达系统中成功制备了不同的截短型GP,可用于GP抗体分析、疫苗效果评价及病毒致病机理的相关研究;一株抗体1B3在细胞水平上和小鼠体内均呈现出较好的中和活性,是有前景的埃博拉病毒治疗药物;对结合表位和中和机制的研究表明,1B3的保护活性可能通过与受体结合区、聚糖帽的共同作用来实现,其作用机制不同于已报道的相关单抗,可为GP入侵机制的研究和单抗鸡尾酒治疗策略的设计提供参考和帮助。