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目的 构建、表达融合有RGD短肽序列的人肿瘤坏死因子凋亡配体(RGD-sTRAIL)表达载体，表达产物RGD-sTRAIL经纯化后检测其体外抑瘤活性以及研究体内对肿瘤组织部位的靶向作用。方法 用PCR方法扩增融合有RGD序列的hTRAIL的114-281位氨基酸的cDNA，扩增产物与质粒载体pGEM3Zf(-)连接，构建克隆载体pGEM-RGD-sTRAIL。在宿主菌DH5 α中扩增重组质粒，由蓝白菌落筛选的方法挑取阳性克隆提取质粒并由限制性内切酶酶谱分析、DNA序列分析两种方法进行鉴定正确后进行酶切回收目的RGD-sTRAIL DNA片段，将目的基因插入pET-11a中构建成表达载体，再次转化大肠杆菌BL21，挑取单菌落提取质粒进行PCR鉴定。鉴定后的阳性克隆用IPTG进行诱导表达，表达产物经SDS-PAGE和免疫学鉴定正确后，纯化包涵体，进行蛋白的变性、复性，复性后蛋白再经离子交换和分子筛进行纯化，得到纯品RGD-sTRAIL，薄层扫描仪扫描凝胶以检测纯度。纯化产物RGD-sTRAIL蛋白以不同浓度处理人肺癌细胞系A549，观察细胞的形态变化并用结晶紫染色法检测RGD-sTRAIL的体外抗肿瘤活性。将纯化后的RGD-sTRAIL和TRAIL蛋白分别经尾静脉注射导入荷瘤小鼠体内，不同时段后处死动物后取肿瘤部位组织，通过免疫组织化学的方法观察目的蛋白在肿瘤部位的分布。结果 经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定以及PCR鉴定证明所构建质粒为pET-RGD-sTRAIL重组质粒，SDS-PAGE证实表达后所获得的融合蛋白分子量为20kD，表达量约占菌体总蛋白的20％，大多数重组蛋白以不溶的包涵体形式存在。Western blot印迹表明目的蛋白具有人sTRAIL的抗原性。纯化后产物SDS-PAGE电泳后经凝胶扫描仪扫描纯度为95％。RGD-sTRAIL处理的细胞，在蛋白浓度大于30ng／ml时，细胞收安徽医科大学硕士学位论文赵丽红·2004年缩变圆且细胞数目明显减少，工C50为1.48ng/m1。免疫组化结果显示:RGD一STRAIL在肿瘤组织部位血管内皮细胞处明显聚集。结论成功构建重组RGD一sTRAIL表达载体，并在大肠杆菌中获得表达，成功获得包涵体复性后的纯化蛋白。复性纯化后的重组蛋白RGD一sTRAIL能明显抑制人肺癌细胞A549生长，并呈剂量依赖性。RGD一sTRAIL在体内具有肿瘤靶向的特性。