研究背景不孕不育是一种危胁人类生殖健康的疾病,也是困扰着全世界的医学难题。据报道,全世界约10%-15%的夫妻患有不孕不育,其中男性因素约占30%-55%。男性不育是指夫妇同居1年以上,在未采取任何避孕措施的条件下,由于男方因素导致女方的不孕。目前研究表明男性不育发生的原因较多且复杂,但其最终引起精子质量的下降及无精子症才是男性不育发生的主要原因。无精子症可以分为梗阻性及非梗阻性无精子症。其中,非梗阻性无精子症约占60%,而梗阻性无精子症约占男性不育的40%。梗阻性无子精症是指睾丸本身的生精功能正常,由于输精管道发生梗阻,导致精液检查查不到精子。非梗阻性无精子症是指由于直接或间接因素作用于睾丸组织,使得精子发生受阻,不能产生成熟的精子,精液检查中查不到精子。尽管,随着生殖医学的发展,梗阻性无精子症患者通过睾丸取精及卵泡浆内单精子注射进行受精,70%以上患者均能成功受精。但非梗阻性无精子症患者睾丸取精成功率较低,仅30%左右患者能通过卵泡浆内单精子注射成功受精。为此,非梗阻性无精子症仍是困扰生殖医学发展的难题。近年来分子遗传生物学已成为各个学科领域研究的热点,遗传因素也已被证实是导致男性不育的重要原因之一。据报道,大约有15%的男性不育是由于遗传因素引起,包括染色体异常和单基因突变,其中,染色体异常占2%-8%,平均5%。染色体异常主要为Y染色体基因的微缺失,近年来研究发现X常染色体易位、基因的突变及缺失也是导致男性不育的重要因素,其表达的缺失与精子的发生障碍密切相关。尽管目前已报道>2300个基因参与正常的精子发生过程,但是明确与男性不育发生相关的单个基因并不多见。因此,男性不育的遗传学研究前景广阔,研究男性不育相关的新型基因具有重要的意义。磷酸核糖焦磷酸合成酶2(PRPS2)为PRPP的家族成员之一,PRPP家族还包括PRPS1和PRPS3, PRPS2位于X染色体的p22.3-p22.2区域锌指蛋白(ZFX)远端,特异地高表达于人、小鼠及大鼠的睾丸组织,与X染色体的失活相关,参与调控嘌呤及嘧啶核苷代谢。目前,关于PRPS2的研究并不多见,PRPS2被认为是C-MYC的靶基因,其参与的核苷酸代谢有助于黑色素瘤细胞的增殖。同时,C-MYC已被证实与生精细胞的凋亡相关,影响精子的发生过程。我们课题组在前期研究中发现PRPS2在唯支持细胞综合征患者睾丸组织中的表达明显高于生精功能正常的睾丸组织,其表达影响支持细胞的凋亡。因此,这些研究结果均提示PRPS2与男性不育相关。然而,PRPS2是否参与正常的精子发生过程,其表达对生精细胞具有什么样的生物学功能,其发挥作用的分子机制是什么,目前尚不清楚。为此,我们开展了本研究。目的1.探讨PRPS2表达与人睾丸组织学类型的关系及其意义。2.探讨PRPS2表达对生精细胞生物学功能的影响。3.探讨PRPS2表达对睾丸精子发生过程的影响。4.探讨PRPS2参与精子发生过程的机制。方法1.免疫组化检测PRPS2表达与睾丸生精功能的关系：收集了163例穿刺活检的睾丸组织标本,病理诊断包括生精功能正常60例,生精功能不良103例。生精功能不良包括：轻度生精功能不良14例,中度生精功能不良33例,重度生精功能不良56例。采用免疫组化检测PRPS2在不同组织学类型睾丸组织中的表达,以半定量方法分析其表达与睾丸生精功能的关系。2. qRT-PCR检测PRPS2表达与睾丸生精功能的关系：收集了生精功能正常、轻度生精功能不良、中度生精功能不良及重度生精功能不良新鲜睾丸组织标本各3例,经组织研磨提取RNA,采用qRT-PCR定量检测PRPS2mRNA表达水平,探讨其表达与睾丸生精功能的关系。3.构建PRPS2敲低及过表达的稳转细胞株：首先通过瞬时转染筛选PRPS2敲低效果最佳的干扰片段,然后包装成慢病毒载体。同时,合成外源性PRPS2过表达载体并包装成慢病毒载体。分别将PRPS2敲低及过表达的慢病毒载体感染小鼠精原细胞GC1及小鼠精母细胞GC2,以空载包装的慢病毒载体作为对照组。通过荧光强度判定转染效率,并行基因序列检测、qRT-PCR及Western blot实验验证。4.体外实验探讨PRPS2敲低及过表达对生精细胞增殖及凋亡的影响：PRPS2敲低及过表达的稳转生精细胞GC1及GC2成功构建后,通过流式细胞仪检测细胞的凋亡及细胞周期。同时,采用MTT实验检测细胞的增殖,并采用免疫组化检测增殖指标Ki-67的表达,综合评定PRPS2敲低及过表达对生精细胞增殖的影响。5.构建生精功能不良的动物模型,探讨PRPS2表达与睾丸生精功能的关系：通过白消安单剂量腹腔注射法构建生精功能不良的小鼠动物模型,注射后2周,取小鼠睾丸及附睾组织。行HE染色,观察睾丸及附睾的形态学改变,评估睾丸的生精功能。随后通过qRT-PCR、Western blot及免疫组化检测PRPS2在正常对照组及生精功能不良组睾丸组织中的表达情况。6. PRPS2敲低对小鼠睾丸生精功能的影响：首先通过qRT-PCR及Western blot定量检测内源性PRPS2在不同周龄小鼠睾丸组织中的表达,评估PRPS2是否参与正常的精子发生及睾丸的发育过程。随后,构建针对小鼠来源的PRPS2敲低慢病毒载体,行小鼠睾丸活体内注射,对照组注射相同剂量的空载慢病毒或不行任何处理。注射后一周取小鼠睾丸组织,通过HE染色,观察不同处理后睾丸的形态学改变,评估睾丸的生精功能。同时,通过qRT-PCR及Western blot定量检测经处理后睾丸组织中PRPS2的表达情况。7.体内实验探讨PRPS2敲低对生精细胞增殖及凋亡的影响：收集PRPS2敲低慢病毒载体处理过的小鼠睾丸组织及对照组小鼠睾丸组织,通过TUNEL实验检测睾丸组织中生精细胞的原位凋亡情况,并检测凋亡相关蛋白Caspase 3、Caspase6及Caspase 9的表达情况,综合评估PRPS2敲低对生精细胞凋亡的影响。通过检测增殖指标Ki-67的表达,进一步评估PRPS2敲低对生精细胞增殖的影响。8.基因芯片初筛PRPS2调控相关的靶基因及相关信号通路：成功构建PRPS2敲低及过表达的GC1细胞株后,通过小鼠基因组芯片筛选获得PRPS2敲低及过表达后发生明显差异表达的基因组,通过GO分析、聚类分析及Pathway分析筛选PRPS2调控相关的下游分子、潜在靶基因及相关信号通路。9. PRPS2与其下游调控靶基因的筛选及鉴定：通过对基因芯片结果的分析可获得PRPS2调控的下游潜在靶基因,随后通过qRT-PCR进行验证。经双荧光素酶报告实验验证PRPS2与下游潜在靶基因是否在转录水平具有直接调控关系,通过Western blot检测二者的表达情况、免疫荧光检测二者表达的定位情况。10.筛选并验证PRPS2调控下游靶基因参与精子发生的信号通路：通过对基因芯片结果的分析可获得PRPS2敲低及过表达激活的下游信号通路,依据PRPS2的生物学功能筛选最佳的信号通路,并采用Western blot进行验证。结果1. PRPS2表达与人睾丸组织学类型的关系及其意义免疫组化结果显示PRPS2阳性表达主要定位于精原细胞、精母细胞、支持细胞及间质细胞的细胞核与细胞质,而在精子细胞及成熟精子中未见明显阳性表达。其中,PRPS2阳性表达主要见于生精功能正常及轻度生精功能不良的睾丸组织,而在中度及重度生精功能不良睾丸组织中的阳性表达较少,统计学分析显示PRPS2在生精功能正常及生精功能不良睾丸组织中的阳性表达率分别为68.3%(41/60),35%(36/103),二者差异明显,具有统计学意义(P=0.000)PRPS2在轻度、中度及重度生精功能不良睾丸组织中的阳性表达率分别为：50%(7/14)、48.5%(16/33)、23.2%(13/56),组内比较,差异具有统计学意义(P=0.02)。采用qRT-PCR定量检测了PRPS2mRNA在生精功能正常、轻度生精功能不良、中度生精功能不良及重度生精功能不良新鲜睾丸组织标本中的表达。结果显示：PRPS2在生精功能正常及轻度生精功能不良睾丸组织中的表达均明显高于其在中度生精功能不良及重度生精功能不良睾丸组织中的表达,差异具有明显统计学意义(P=0.000)。然而,PRPS2在生精功能正常睾丸组织中的表达与轻度生精功能不良睾丸组织中的表达无明显差异(P>0.05)。2. PRPS2表达对生精细胞生物学功能的影响首先,我们通过siRNA干扰片段,瞬时转染了小鼠精原细胞株GG1及小鼠精母细胞株GC2,筛选出PRPS2敲低效果最佳的干扰片段构建了慢病毒载体。随后,我们克隆了外源性PRPS2质粒,构建了PRPS2过表达的慢病毒载体。以空载序列构建的慢病毒载体作为对照,我们分别通过基因序列的检测验证了PRPS2干扰及过表达载体构建序列的正确性。随后,我们将PRPS2干扰、过表达及空载对照组慢病毒载体分别感染GC1及GC2细胞株。在荧光显微镜下观察,我们发现细胞的感染效率较高(>90%)。同时,qRT-PCR及Wstern blot检测均表明经慢病毒感染后,PRPS2在GC1及GC2细胞中的表达成功被敲低及过表达。随后,我们通过流式细胞仪检测了细胞的凋亡率,结果表明PRPS2表达敲低后,GC1细胞的凋亡率为16.1%±3.0%,与对照组相比(2.8%±0.2%),差异明显,具有统计学意义(P=0.000)。而PRPS2过表达后,GC1细胞的凋亡率为0.6%±0.3%,与对照组相比(2.8%±0.2%),差异也具有统计学意义(P=0.000)。同时,PRPS2表达敲低后,GC2细胞的凋亡率为18.7%±1.9%,与对照组相比(4.0%±0.2%),差异明显,具有统计学意义(P=0.000)。而PRPS2过表达后,GC2细胞的凋亡率为1.9%±0.2%,与对照组相比(4.0%±0.2%),差异也具有统计学意义(P=0.000)。同时,我们通过流式细胞仪检测了PRPS2表达对生精细胞生长周期的影响,结果表明PRPS2表达敲低后,GC1细胞的S期细胞的比例为28.05%±1.5%,与对照组相比(37.9%±3.6%),差异明显,具有统计学意义(P-=-0.012)。而PRPS2过表达后,S期细胞比例为49.6%±3.6%,与对照组相比,差异也具有统计学意义(P=0.016)。同样,与对照组相比,在GC2细胞中,PRPS2表达敲低后S期细胞比例明显降低(39.0%±1.7% VS 46.3%±0.2%),差异明显,具有统计学意义(P=0.002),而PRPS2过表达后,S期细胞比例明显增加(53.8%±2.5%),差异也具有统计学意义(P=0.034)。为了探讨PRPS2表达对生精细胞增殖的影响,我们进行了MTT实验,连续观察5天,结果表明：与对照组相比,PRPS2在GC1细胞中的表达敲低后,细胞的增殖能力明显下降,而PRPS2过表达后,细胞的增殖能力明显增强,(P=0.000)。同样,在GC2细胞中,PRPS2表达下调后,细胞的增殖能力明显低于对照组,而PRPS2过表达后,细胞的增殖能力明显高于对照组(P=0.000)。同时,与对照组相比,PRPS2表达下调后,Ki-67在GC1及GC2细胞中的表达明显减弱,而PRPS2表达上调后,Ki-67在GC1及GC2细胞中的表达明显增强。3. PRPS2表达对皋丸精子发生过程的影响首先,为了明确内源性PRPS2是否表达于正常的睾丸组织,我们通过qRT-PCR及Western blot检测了PRPS2在小鼠出生后4W、6W、8W及10W睾丸组织中的表达,结果显示：随着小鼠周龄的增加,PRPS2表达逐渐增加,提示PRPS2参与睾丸的正常发育过程。随后,我们将PRPS2干扰片段慢病毒载体行活体内小鼠睾丸注射,观察1周后小鼠睾丸组织的形态学改变。结果表明PRPS2干扰片段慢病毒载体活体内注射1周后,干扰组中PRPS2表达水平明显低于空载对照组及空白对照组,差异具有统计学意义(P=0.000)。PRPS2表达下调后,睾丸组织内多数生精小管被破坏,生精小管内各级生精细胞明显减少,精子发生过程发生明显异常,表达为明显的生精功能不良。而在空载对照组中,仅看到极少部分生精小管被破坏,大多数生精小管未受影响,精子发生大致正常。空白对照组未发现生精小管被破坏,精子发生正常。随后,为了进一步探讨PRPS2表达与睾丸生精功能的关系,我们通过白消安构建了生精功能低下的小鼠动物模型。免疫组化检测了PRPS2在小鼠睾丸组织中的表达,结果显示PRPS2明显高表达于精原细胞、精母细胞、支持细胞及间质细胞,而成熟精子中未见明显阳性表达,当睾丸发生明显生精功能低下后,PRPS2在生精小管中的表达也明显下降,而其在间质细胞中的表达无明显变化。Western blot及qRT-PCR检测结果也均显示PRPS2在生精功能不良睾丸组织中的表达明显下降。其次,为探讨PRPS2表达对生精细胞凋亡的影响,我们通过TUNEL实验检测了睾丸组织中PRPS2下调后生精细胞的凋亡情况。结果显示：与空白对照组及空载组相比,干扰组中凋亡的生精细胞数量明显增加。同时,凋亡相关蛋白Caspase 3、Caspase 6及Caspase 9表达均明显增强。最后,我们评估了PRPS2表达下调对生精细胞增殖能力的影响。结果显示：Ki-67在空白对照组及空载组睾丸组织中均阳性表达于精原细胞及间质细胞,而在干扰组中Ki-67的表达明显减弱,提示PRPS2表达下调后,生精细胞的增殖能力下降。4. PRPS2参与精子发生过程的机制研究为了寻找PRPS2参与调控的信号通路,我们将PRPS2敲低、过表达及空载对照组的GC1细胞株进行高通量基因芯片分析,结果表明PRPS2敲低组与对照组相比,差异显著(P<0.05)的基因共有2543个,其中包括1571个基因出现明显上调,972个基因出现明显下调。PRPS2过表达组与对照组相比,差异显著(P<0.05)的基因共有3131个,其中包括1582个基因出现明显上调,1549个基因出现明显下调。PRPS2表达下调涉及的信号通路主要为细胞骨架、分化、细胞周期、细胞粘附、细胞连接及凋亡。PRPS2过表达所涉及的信号通路主要为细胞骨架、细胞周期、分化、凋亡、细胞粘附及细胞分裂。经qRT-PCR验证,我们发现E2F1为PRPS2正向调控的下游潜在靶基因。PRPS2表达下调后E2F1mRNA表达明显下降,而PRPS2过表达后E2F1mRNA表达明显增加。为验证PRPS2是否在转录水平调控E2F1,我们构建了E2F1的荧光素酶载体,分别转染PRPS2过表达及空载对照组的GC1及GC2细胞。结果显示：与对照组相比,PRPS2过表达的GC1(GC1/PRPS2)及GC2(GC2/PRPS2)细胞中E2F1的荧光素酶活性明显增强(P<0.05),提示PRPS2在转录水平可以直接调控E2F1的表达,E2F1可能为PRPS2调控的靶基因。同时,免疫荧光结果显示PRPS2及E2F1均阳性表达于小鼠GC1及GC2细胞及生精功能正常的人睾丸组织,且都定位于细胞核及细胞浆,二者表达具有明显的共定位。PRPS2敲低的GC1及GC2细胞中均发现E2F1的荧光强度减弱,而在PRPS2过表达的GC1及GC2细胞中均发现E2F1的荧光强度增强,提示PRPS2表达正向调控E2F1表达。这些结果均一致表明PRPS2在蛋白水平也能正向调控E2F1表达。为验证PRPS2正向调控E2F1是否参与调控细胞的增殖及凋亡,我们构建了外源性E2F1质粒,并分别转染了PRPS2敲低的GC1及GC2细胞株。结果显示,与GC1/shPRPS2组相比,转染了外源性E2F1质粒的GC1/shPRPS2/E2F1组细胞凋亡率明显减少(P<0.05),而增殖能力明显增强(P<0.05)。同样,与GC2/shPRPS2组相比,转染了外源性E2F1质粒的GC2/shPRPS2/E2F1组细胞凋亡率明显减少(P<0.05),而增殖能力也明显增强(P<0.05)。这些结果提示E2F1受PRPS2调控,并影响细胞的凋亡及增殖。为验证PRPS2参与的凋亡及增殖相关信号通路,我们采用Western blot实验进行了验证。结果显示：PRPS2表达下调后,E2F1表达明显下降,P53表达明显增强,同时Caspase 6及Caspase 9表达明显增强,而Bcl-2及Bcl-xl表达明显下调。相反,PRPS2过表达后,E2F1表达明显增加,P53表达明显下调,Caspase6及Caspase 9表达也明显减少,而Bcl-2及Bcl-xl表达明显上调。此外,我们也发现PRPS2表达下调激活了CDKN2A的表达,而PRPS2过表达抑制了其表达。这些结果提示PRPS2参与细胞凋亡及增殖的机制与其对E2F1、P53、Bcl-2、 Bcl-xl、Caspase 6、Caspase 9及CDKN2A的调控相关。结论1.PRPS2表达与人睾丸组织学类型相关,其表达的检测有助于评估睾丸的生精功能。2.PRPS2参与正常的精子发生及睾丸发育过程,其表达下调与睾丸生精功能不良相关。3.PRPS2表达下调有助于生精细胞的凋亡,并抑制生精细胞的增殖,其作用机制与E2F1/P53/Bcl-2/Bcl-xl/Caspase 6/Caspase 9/CDKN2A信号通路相关。