棉大卷叶螟丝素P25基因的克隆、表达分析及功能验证

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棉大卷叶螟(Sylepta derogata Fabricius)属鳞翅目螟蛾科,是一种分布广泛的多食性害虫。为了深入了解棉大卷叶螟的吐丝机理,本文研究了棉大卷叶螟丝素P25基因,通过基因克隆技术得到其cDNA序列全长,并检测分析在不同发育阶段、取食不同寄主后棉大卷叶螟丝素P25基因的相对表达量。以此为基础,进行RNA干扰试验,采用饲喂法干扰其丝素P25基因的表达,从而进行功能验证。主要研究结果如下:  1、通过比对其他已知的鳞翅目昆虫的丝素P25基因,运用RACE法克隆得到棉大卷叶螟丝素P25基因全长。棉大卷叶螟丝素P25基因cDNA全长为859bp,起始密码子为ATG,终止密码子为TAG,编码区全长为663bp,并将所获得的基因全长提交到GenBank,登录号为KY792994。依据棉大卷叶螟丝素P25基因的核苷酸序列转换为其氨基酸序列,并加以分析,估算该蛋白分子量为25.653kDa,等电点pI为8.02。将所获得的基因全长同已经登录到GenBank的其他昆虫丝素P25基因序列进行同源性比对,与大蜡螟(Galleria mellonella)的同源性最高,达到63%,其次为外米缀蛾(Corcyra cephalonica),同源性为62%。  2、运用实时定量PCR技术,检测分析在不同发育阶段、取食不同寄主后棉大卷叶螟丝素P25基因的相对表达量。分析结果表明,丝素P25基因的相对表达量与棉大卷叶螟的虫龄、虫态变化紧密相关。P25基因相对表达量的特点主要体现在2L幼虫和预蛹期各有一个高峰,其中预蛹期的表达量最高;1龄,3龄,5龄幼虫丝素P25基因的表达量相对较低;蛹期及羽化后,丝素P25基因的表达量快速下降,近乎于零;饲喂苘麻叶片的棉大卷叶螟2龄幼虫丝素P25基因的相对表达量最高,蜀葵和棉花次之,且蜀葵略高于棉花,木槿最低。  3、将表达棉大卷叶螟丝素P25基因dsRNA的菌液以饲喂法的方式干扰其幼虫目标基因的表达。喂食不同菌液浓度的试验结果表明,喂食表达dsRNA菌液后相对表达量均有所下降。而喂食不同虫龄棉大卷叶螟幼虫不同天数菌液的试验结果表明,饲喂菌液天数越长,表达量均会呈现下降趋势,其中3龄幼虫的下降幅度要小于其他虫龄,且对5龄幼虫的干扰效果最好。在不同寄主上饲喂菌液的试验结果表明,饲喂菌液后,不同寄主上的棉大卷叶螟2龄幼虫丝素P25基因表达量均有所下降,其中以苘麻为寄主的幼虫丝素P25基因表达量显著下降。以上试验结果表明菌液浓度、取食时间、取食虫龄、取食寄主均会对丝素P25基因干扰效率产生影响。
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