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本文主要从以下几个部分展开论述： 第一部分 二甲双胍对HaCaT角质形成细胞活性及活性氧水平的影响 目的:观察二甲双胍药物刺激后实验组及对照组细胞的形态学变化，并运用CCK-8法和流式细胞检测方法，检测二甲双胍对HaCaT角质形成细胞活性、凋亡及活性氧水平的影响。 方法:1.分为不同浓度二甲双胍实验组、对照组。HaCaT角质形成细胞分别以2x105/ml的密度接种。37℃在5％CO2孵箱中培养过夜。以0、10、20、40、60mmol/L不同浓度的二甲双胍分别对体外培养的HaCaT角质形成细胞进行药物刺激，在刺激后24h，(1)CCK-8法检测各组细胞的活性情况。(2)用不含EDTA的0.25％胰酶消化HaCaT细胞并收集于流式管，Annexin V-FITC标记，应用流式细胞检测各组细胞的凋亡状况。 2.活性氧清除剂NAC预处理下，二甲双胍对HaCaT细胞产生活性氧(ROS)、细胞活性及凋亡的影响。分对照组、二甲双胍组、二甲双胍+NAC组。二甲双胍+NAC组先用终浓度为10mM的NAC溶液预处理1小时。(1)活性氧(ROS)的影响。在刺激后24h，DCFH-DA探针标记，胰酶消化HaCaT细胞并收集于流式管，应用流式细胞仪检测各组细胞活性氧水平。(2)在刺激后24h，CCK-8法检测各组细胞的活性情况。 结果:(1)CCK-8法检测不同浓度二甲双胍对HaCaT细胞活性的影响。结果显示，对照组、10mM、20mM、40mM、60mM二甲双胍组细胞的平均存活率分别为100.00±0.00％、99.27±0.46％、78.77±2.00％、70.47±1.43％和29.57±2.31％。与对照组相比，10mM二甲双胍组细胞的活性无明显变化(P＞0.05)。当二甲双胍浓度≥20mM时，能明显抑制HaCaT细胞的生长，并呈浓度依赖性，与对照组相比，P＜0.01，差异有统计学意义。(2)二甲双胍对HaCaT角质形成细胞形态的影响。倒置显微镜下观察二甲双胍作用前后HaCaT细胞生长状态，对照组和10mM二甲双胍组细胞大小均匀一致，较饱满，细胞边界清楚，簇集分布，贴壁生长，细胞间连接较紧密。 结论:二甲双胍通过提高HaCaT细胞内活性氧水平而发挥抑制细胞增殖、促细胞凋亡作用，并呈浓度依赖性。 第二部分二甲双胍调控Nrf2对HaCaT角质形成细胞活性及活性氧水平的影响 目的:应用Western blot、实时荧光定量PCR检测不同浓度二甲双胍对Nrf2、p-Nrf2蛋白水平、Nrf2mRNA水平表达的影响;Nrf2激动剂oltipraz(OPZ)与二甲双胍共同作用于HaCaT细胞，检测其产生活性氧(ROS)水平及增殖、凋亡的变化。探讨二甲双胍促HaCaT细胞凋亡的分子作用机制。 方法:取对数生长期的HaCaT角质形成细胞以2×105/ml密度接种培养过夜。 1.应用Western blot、实时荧光定量PCR检测不同浓度二甲双胍对Nrf2、p-Nrf2蛋白水平、Nrf2mRNA水平表达的影响。实验分为不同浓度二甲双胍实验组、对照组。24h后，以0、10、20、40、60mmol/L不同浓度的二甲双胍对其进行药物刺激。(1)在药物作用24h后，分别抽提细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和转膜，用5％脱脂奶粉封闭非特异抗原，加入Nrf2、p-Nrf2--抗，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次后，加入含辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗反应1h，显色后化学发光系统采集图像。实验以GAPDH作为内参照。(2)在药物作用24h后，分别抽提细胞总RNA，RNA定量，RNA反转录为cDNA，放入荧光定量PCR仪进行反应。 2.Nrf2激动剂oltipraz(OPZ)与二甲双胍共同作用于HaCaT细胞，检测对其增殖、凋亡及产生活性氧(ROS)的影响，分对照组、二甲双胍组（终浓度为40mM）、二甲双胍（终浓度为40mM）+OPZ（终浓度为25uM）组。(1)活性氧(ROS)的影响。在刺激后24h，DCFH-DA探针标记，胰酶消化HaCaT细胞并收集于流式管，应用流式细胞仪检测各组细胞活性氧水平。(2)在刺激后24h，CCK-8法检测各组细胞的活性情况。(3)在刺激后24h，用不含EDTA的0.25％胰酶消化HaCaT细胞并收集于流式管，Annexin V-FITC标记，应用流式细胞检测各组细胞的凋亡状况。 结果:(1)不同浓度二甲双胍作用于HaCaT细胞24h后，Western-blot检测HaCaT细胞Nrf2、p-Nrf2蛋白水平。结果显示，与对照组比较，浓度为20、40、60mmol/L的二甲双胍组，Nrf2蛋白相对水平分别平均下降32.73％、54.17％和60.24％;p-Nrf2蛋白水平分别平均下降26.39％，35.51％，49.51％。P＜0.01，差异有统计学意义。(2)不同浓度二甲双胍作用于HaCaT细胞24h后，qRT-PCR检测HaCaT细胞Nrf2mRNA水平。结果显示，与对照组比较，浓度为20、40、60mmol/L的二甲双胍组，Nrf2mRNA相对表达水平分别平均下降17.64％、30.30％和43.40％。P＜0.01，差异有统计学意义。 结论:二甲双胍通过降低细胞Nrf2的表达升高活性氧水平而发挥抑制细胞增殖、促细胞凋亡作用。 第三部分二甲双胍对HaCaT角质形成细胞Raf-1-ERK1/2-Nrf2信号通路活性的影响 目的:应用Western-blot检测不同浓度二甲双胍对RAF-1、p-RAF-1、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白水平表达的影响及MEK抑制剂U0126对ERK1/2、p-ERK1/2、Nrf2及p-Nrf2蛋白水平表达的影响。进一步探讨二甲双胍促HaCaT细胞凋亡的分子作用机制。 方法:取对数生长期的HaCaT角质形成细胞以2×105/ml密度接种培养过夜。 1.应用Western-blot检测不同浓度二甲双胍对RAF-1、p-RAF-1、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白水平表达的影响，在药物作用24h后，分别抽提细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和转膜，用5％脱脂奶粉封闭非特异抗原，加入RAF-1、p-RAF-1、ERK1/2及p-ERK1/2一抗，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次后，加入含辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗反应1h，显色后化学发光系统采集图像。 2.Western-blot检测MEK抑制剂U0126对ERK1/2、p-ERK1/2、Nrf2及p-Nrf2蛋白水平表达的影响。分对照组、0.1％DMSO组、U0126组(终浓度为10uM)。在药物作用24h后，分别抽提细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和转膜，用5％脱脂奶粉封闭非特异抗原，加入ERK1/2、p-ERK1/2、Nrf2及p-Nrf2一抗，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加入含辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗反应1h，显色后化学发光系统采集图像。实验以GAPDH作为内参照。 结果:不同浓度二甲双胍作用于HaCaT细胞24h后，Western-blot检测HaCaT细胞RAF-1、ERK1/2、p-RAF-1及p-ERK1/2蛋白水平。结果显示，浓度为20、40、60mmol/L的二甲双胍组，RAF-1蛋白水平分别平均下降16.90％、56.35％和79.45％;p-RAF-1蛋白水平分别平均下降28.76％、60.10％、81.97％;ERK1/2蛋白水平分别平均下降29.87％、36.46％、63.37％;p-ERK1/2蛋白水平分别平均下降17.34％、35.46％、49.48％。与对照组比较，P＜0.01，差异有统计学意义。 结论:二甲双胍通过抑制Raf-1/ERK1-2信号通路的活性而降低Nrf2的表达。 与目前已有的报道相比较，本文的创新点主要在以下几个方面: (1)首次就二甲双胍对HaCaT细胞活性氧水平的表达来探讨其对HaCaT细胞增殖、凋亡作用的影响，并证实二甲双胍通过提高HaCaT细胞内活性氧水平而发挥抑制细胞增殖、促细胞凋亡作用，并有浓度依赖性。 (2)首次就二甲双胍对HaCaT细胞Nrf2水平的表达来探讨其对HaCaT细胞增殖、凋亡作用的影响，并证实二甲双胍可以抑制Nrf2和p-Nrf2蛋白水平及Nrf2mRNA水平的表达，通过抑制HaCaT细胞Nrf2的表达提高细胞内活性氧水平而发挥促细胞凋亡作用的。 (3)首次就二甲双胍、HaCaT细胞活性氧(ROS)水平、Raf-1-ERK1/2-Nrf2信号通路、HaCaT细胞活性之间的关系进行系统实验研究，并证实二甲双胍通过抑制HaCaT细胞Raf-1-ERK1/2-Nrf2信号通路活性而提高细胞内活性氧水平，进一步发挥其促细胞凋亡的作用。 本论文较为详尽地研究了二甲双胍、HaCaT角质形成细胞活性氧(ROS)水平、Raf-1-ERK1/2-Nrf2信号通路、HaCaT细胞活性之间的关系，为它们作为治疗银屑病的新靶点提供了实验和理论基础。探讨二甲双胍对角质形成细胞作用的具体分子机制，将有利于进一步了解此药，为其作为银屑病的治疗方案提供更为有力和直接的证据，具有一定的理论意义与实际价值。