微孢子虫是一类专营细胞内寄生，无线粒体的单细胞原生动物。微孢子虫的动物学分布范围非常广，能感染寄生脊椎动物和无脊椎动物，是经济昆虫、鱼类、兔类、皮毛动物、啮齿类及灵长类动物的致命病原。从1857年Nageli在家蚕中发现家蚕微粒子(Nosema bombycis)后，近二十年来，已相继从家蚕体内分离到微粒子虫属(Nosema)、具褶孢虫属(Pleistophora)、泰罗汉孢虫属(Tbelobania)、变形孢虫属(Vairimorpha)、和内网虫属(Endoreticulatus)等其它病原性微孢子虫。展开对有关微孢子虫的研究对于稳定生产、卫生防疫和环境生态诸方面都有着重要意义。养蚕业作为我国的传统产业，在农业上一直占有重要的经济地位。而由家蚕微孢子虫N.bombycis引起的家蚕微粒子病则是养蚕业的毁灭性病害。由于家蚕微孢子虫能经卵传染危害家蚕子代而被列为蚕种生产唯一的检疫对象，因此这一领域一直是蚕病学的研究重点和热点。本研究以家蚕微孢子虫N.bombycis的蛋白质尤其是表面蛋白为研究对象，对其进行分离纯化及其相关领域的分析研究。得出如下研究结果： 一、家蚕微孢子虫N.bombycis表面蛋白P32.7的分离纯化及测序 采用Percoll法对感染家蚕的微孢子虫N.bombycis进行纯化，得到的微孢子虫均一性和折光性一致，无组织碎片和杂菌，纯度高，对微孢子虫活性影响小，适合进一步实验的要求。然后用SDS法提取家蚕微孢子虫的表面蛋白，经SDS-PAGE电泳，结果显示，家蚕微孢子虫表面蛋白有三条主带，而且分子量较为接近。 将SDS处理前后的家蚕微孢子虫镜检，发现SDS处理后微孢子虫的形态没有大的改变，只是孢子个体变小，活动能力下降，对家蚕的致病力明显减弱。 通过制备性SDS-PAGE、高效液相色谱反相HPLC层析对家蚕微孢子虫N.bombycis表面蛋白P32.7进行了分离纯化。经过SDS-PAGE分析表现为单带，反相HPLC检测表现为单峰，符合测序的要求。 对表面蛋白P32.7采用Edman降解法进行了N端氨基酸测序，其N端10个氨基酸的序列为N-Glu Pro Thr Arg His His Asp Arg Tyr Ala-C。 二、家蚕微孢子虫N.bombycis总蛋白的电泳分析 采用极丝激发-冻融法提取家蚕微孢子虫N.bombycis的孢子总蛋白，通过SDS-PAGE对孢子总蛋白进行分析。电泳结果显示家蚕微孢子虫总蛋白呈现复杂的带型，总共出现有30多条条带。 三、家蚕微孢子虫N.bombycis表面蛋白P30.4基因5’末端外延区段的分析 本研究室曾克隆出家蚕微抱子虫N bohoCcfs表面蛋白 P30．4的 cDNA序列，但经分析，发现该序列缺少起始密码子，且对其的功能分析不完全。本实验在过去研究的基础上，对家蚕微抱子虫表面蛋白P30．4基因的5’末端外延区段进行了进一步的分析。以该 CDNA序列为基础合成引物，利用快速扩增 CDNA末端 RACE技术（5’－RACE），以家蚕微抱子虫 N b孤吟网拈 RNA反转录的 CDNA为模板进行扩增。得到一个大小约为400hP的DNA特异片段。 采用TA克隆法对该目的片段进行了克隆测序，测出的序列具有引物，共395hP。通过BLAST等软件与己克隆的家蚕微泡子虫表面蛋白P30．4的cDNA序列比较分析，发现该片段与其同源性为 97％，但包括于其序列中，没能得到表面蛋白 P30．4基因 5’末端外延区段的序列。分析其原因，可能与材料、引物的设计和扩增等诸多方面的因素有关。四、家蚕微抱子虫 N bm吨比拈表面蛋白 P30．4基因内含子序列的研究 为进一步了解家蚕微抱子虫表面蛋白P30．4基因的结构等问题，对其内含子序列进行了分析。以家蚕微泡子虫表面蛋白P30．4的CDNA序列为基础，在其两端合成引物，以家蚕微抱子虫八： bhajs的基因组 DNA为模板进行扩增。得到两条 DNA特异片段：一条大小约为750hP，另一条大小约为400hP。 采用TA克隆法对两条特异片段进行了克隆测序。其中7 50hP的片段测出的序列共 78fop，经NCBI卜较，该片段和鼠疫杆菌 （Yersini pestis strain）中的 168个核昔酸有84％的同源性。而400hP的片段测出的序列共360hP，但仅有引物，NCBI数据库中没有和其同源的序列。这两个片段的结构和功能还有待于进一步的研究。 由于家蚕微抱子虫是比较低等的原生动物，根据越是低等的生物其内含子及基因间序列越少的原则，家蚕微抱子虫表面蛋白P30·4基因内含子序列的有无还有待于进。一步的论证。