目的通过比较慢速连续降温法、慢速梯度降温法、玻璃化冻存法对兔关节软骨细胞生物学特性的影响,选择较好的保存方法,为组织工程化关节软骨修复软骨缺损的临床应用提供实验依据。方法2-4周龄新西兰大白兔,无菌条件下取其关节软骨细胞,进行体外的原代培养。分别用慢速连续降温法、慢速梯度降温法、玻璃化冻存法将所取的兔关节软骨细胞进行冻存,冻存时间为2周、1个月后取出部分冻存管,37℃水浴复温后调定细胞浓度观察,以新鲜软骨细胞组作为对照组。对照组直接原代培养后检测软骨细胞生长活力及其生物学特性。慢速连续降温法是将细胞悬液和冻存液的混合液,分别装入冻存管,放入程控冰箱,以1℃/min的速度连续降温至-80℃后,迅速放入液氮中保存的方法。慢速梯度降温法是将细胞悬液和冻存液的混合液在降至-80℃之前,分4个梯度降温的保存方法。玻璃化冻存法是将细胞悬液和玻璃化冻存液混合后,以最快的速度直接投入液氮中保存的方法。不同冻存方法的细胞于冻存2周、1个月时取出,行甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞表型、CCK8法绘制软骨细胞生长曲线、Western blot方法检测II型胶原表达,RT-PCR检测II型胶原mRNA的表达情况。以新鲜软骨细胞组作为对照组,比较各实验组软骨细胞的不同保存情况。结果1.软骨细胞的形态观察以及生长情况在显微镜下观察:分离培养的原代软骨细胞呈圆球形,呈悬浮状态,接种24h后大部分细胞开始沉降于培养瓶壁上,36h后贴壁率可达90%左右。贴壁后,细胞逐渐展开、变平、伸出短小的突出,外观呈多角形、不规则形。细胞胞质丰富,胞核清楚,核圆形或椭圆形,位于胞体中心,核仁为1-3个,具有折光性。约7d左右汇合成单层铺满整个培养皿底面。传代后生长速度加快,约5d左右即可传代,细胞周围可见具有折光性的细胞外基质,细胞长成一片可呈明显的“铺路石”状外观。冻存2周复苏后,慢速梯度降温冷冻法的细胞生长形态较接近于新鲜软骨细胞。慢速连续降温组和玻璃化组,细胞呈长梭形或多角形,细胞数目少。冻存1个月时,实验组细胞生长形态均较对照组有明显区别,细胞胞质减少,胞核不清晰。甲苯胺蓝染色显示,新鲜软骨细胞经细胞爬片后进行甲苯胺蓝染色后镜下观察,软骨细胞染成蓝紫色,有核仁1-2个,对数生长期细胞明显可见多数细胞有丝分裂相,细胞胞浆内见蓝紫色异染颗粒,细胞外基质染成浅蓝色,集落样生长区中心浓染成紫红色。随着细胞传代,染色逐渐变浅变淡。冻存2周、1个月时,各实验组于胞浆中仍可见蓝紫色异染颗粒,说明经传代以及冻存后,各组细胞仍保持软骨细胞表型。2.软骨细胞活性的变化新鲜软骨细胞组细胞生长曲线成对数型,保存2周、1个月时,各实验组同对照组比较,细胞活性均较新鲜细胞组差。不同实验组在冻存2周、1个月的时间点上,细胞生长活力冻存2周的生长情况要好于冻存1个月的细胞且差异明显,有统计学差异(P<0.05)。冻存2周时,慢速梯度降温冷冻法组的细胞生长情况明显优于慢速连续降温法和玻璃化冻存法,有统计学差异(P<0.05)。冻存1个月时,慢速梯度降温冷冻法组的细胞生长情况明显优于慢速连续降温法和玻璃化冻存法,有统计学差异(P<0.05)。不同冻存方法对软骨细胞生长活力的影响不同且随冻存时间的变化对软骨细胞存活和率的影响也不同。随冻存时间的延长,曲线的峰值出现的时间推后并且峰值降低。3.软骨细胞的生物学特性II型胶原表达冻存2周时,慢速连续降温法、慢速梯度降温法、玻璃化冻存法的II型胶原表达均减少与新鲜软骨细胞组比较有统计学差异(P<0.05);慢速连续降温法、慢速梯度降温法、玻璃化冻存法的II型胶原表达两两比较有统计学差异(P<0.05)。冻存1个月时,慢速连续降温法、慢速梯度降温法、玻璃化冻存法的II型胶原表达比较有统计学差异(P<0.05)。在两个时间点上,慢速梯度降温法、玻璃化冻存法、慢速连续降温法,冻存2周、1个月组内两两比较有统计学差异(P<0.05)。4.软骨细胞II型胶原mRNA的表达四组的mRNA扩增产物中都能看到预期长度的II型胶原特异性条带。新鲜软骨细胞组II型胶原mRNA表达最强,与其它各组相比均有显著差异。冻存2周时,三种的冻存方法中,慢速梯度降温冷冻法组对II型胶原mRNA表达减少最弱,与慢速连续降温法比较有显著差异,与玻璃化冻存方法比较有显著差异;慢速连续降温法与玻璃化冻存方法比较无显著差异。冻存1个月时,慢速梯度降温冷冻法组的mRNA表达明显高于慢速连续降温法组和玻璃化冻存方法组,但低于慢速梯度降温冷冻法组冻存2周时mRNA表达。结论1.慢速梯度降温冷冻法对软骨细胞活性及其生物学特性的影响较小,有一定的临床应用价值。2.慢速梯度降温冷冻法、玻璃化冻存法、慢速连续降温冷冻法对关节软骨细胞的影响均具有时间依从性,随着时间的推移,软骨细胞生物活性逐渐下降。意义虽然治疗各种关节软骨缺损的方法非常多,但均不能达到理想的修复效果,不能恢复其原有的生物力学性能。组织工程化关节软骨的构建,为上述问题提供了更好的解决办法。而构建组织工程化关节软骨需要大量的种子细胞,同种异体软骨细胞是种子细胞的一个重要来源但数量有限,且受到法律和伦理道德方面的约束,因此如何长期保存并大量应用目前并没有成熟的方法。本实验通过比较目前常见的几种冻存方法,筛选出较好的冻存方法保存种子细胞,为构建组织工程化关节软骨修复关节软骨缺损的临床应用提供实验依据。