猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌,属于链球菌属α型(羊血)或β型(马血)溶血性链球菌,有35个血清型(1-34型及1/2型),其中2型(S.suis serotype2,SS2)是分布最广,致病性最强的型别之一。猪感染S.suis可引起脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎、多发性浆膜炎、流产和败血症,并能导致猝死。人感染S.suis后,通常出现化脓性脑膜炎、心内膜炎、伴有耳聋、运动功能紊乱,败血症等症状,严重的病例发生中毒性休克综合征(streptococcus toxic shock syndrome,STSS),导致多脏器衰竭及死亡。自1968年丹麦首次报告人感染S.suis罹患脑膜炎的病例以来, S.suis已演变成为在世界范围内流行的人兽共患病。1998和2005年,我国两次爆发人感染猪链球菌疫情,造成巨大的经济损失和社会危害。研究S.suis的致病机制对控制其对公共健康和社会发展造成的危害有重要意义。　　目前,对S.suis的研究主要集中在毒力因子的分离和鉴定方面。已鉴定的毒力因子包括荚膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)、溶菌酶释放蛋白(muramidase released protein,MRP)、细胞外蛋白因子(extracellular factor protein,EF)、溶血素(suilysin,SLY)、黏附素(adhesin)、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)及纤连蛋白结合蛋白(fibronectin binding protein of S.suis,FBPS)等。但是,目前对毒力因子的研究还不能从全局的角度深入的动态的解释S.suis的致病机制。而研究控制这些毒力基因发挥作用的调控系统能在某种程度上解决这一难题。　　以往的研究发现,细菌中常见的调控系统有密度感应系统(Quorum Sensing Systems, QSs)、双组分调控系统(Two-component systems,TCSs)以及各种转录调节因子等。通过对化脓链球菌、金黄色葡萄球菌等病原菌的研究,国际上已经阐明了一些链球菌调控系统,并对它们的结构、功能、相互作用及其调节方式作了初步诠释,为从全局角度了解细菌的调控机制提供了丰富的资料和技术。目前,国内外对S.suis调控系统的研究主要集中在少数几个双组分调控系统上,如RevS、SalKR和CovR等。但这些研究还不足以全面揭示的S.suis致病机理,因此有必要鉴定出更多的调控系统,并研究其在S.suis致病过程中所发挥的调节作用,为建立更加系统、准确的S.suis致病理论提供基础和依据。　　经过生物信息学分析,在S.suis中发现了一个与Rgg同源的转录调控因子--基因SSU05_1997。Rgg蛋白家族广泛存在于G+C含量低的革兰氏阳性细菌中,通常在细菌中发挥全局调控因子的作用。在 A族链球菌、B族链球菌和变形链球菌中,rgg控制着细菌的碳水化合物和氨基酸代谢通路,影响细菌的生长状态,以适应细菌致病过程中所遇到的环境变化。Rgg还可以通过调节甚至开启和关闭很多其它调控系统来影响细菌基因组上多个毒力基因的转录。鉴于rgg在控制细菌的生长代谢和毒力基因的表达等方面起着举足轻重的作用,研究rgg在S.suis中的调控作用无疑为揭示S.suis的致病机制提供了新的出路。因此,本研究拟构建SS2强毒株05ZYH33的rgg基因敲除突变体,进而鉴定其所控制的差异表达基因和差异表达蛋白,阐明其在SS2基因中所发挥的调控作用。　　本研究第一部分构建rgg基因敲除突变株并进行生物学表型分析。分别以SS2强毒株05ZYH33基因组和pSET1质粒为模板,扩增基因SSU05_1997两侧各约500bp左右的片段为上下游同源臂,氯霉素抗性基因Cm为中间片段,采用重叠PCR方法连接三个片段。将连接产物克隆到温敏自杀载体pSET4S上,构建基因敲除载体pSET4S-1997,电转化入05ZYH33感受态细胞,通过改变培养温度筛选出基因敲除突变体05ZYH33△rgg。PCR分析和测序结果均显示基因SSU05_1997完全被氯霉素抗性基因Cm所替代,基因敲除突变体构建成功。CD1小鼠腹腔注射攻毒实验和猪耳静脉注射竞争感染实验发现,敲除株的生物学性状以及对小鼠和猪的毒力与野生株相比无明显差异。但在细胞实验中,我们通过抗生素平板计数法比较敲除株和野生株对上皮细胞Hep-2的黏附能力发现,敲除株的黏附能力显著降低。　　本研究第二部分通过基因芯片分析野生株与敲除突株之间的差异表达基因。在突变体中共发现45个基因表达量变化在2倍以上,其中19个基因表达上调,26个基因表达下调。这些基因在细菌毒力、免疫抗原、DNA合成和修复、以及基础代谢和ABC转运系统等方面起着重要作用。这一结果与实时定量PCR验证结果相一致。芯片杂交数据与实时定量PCR验证比较显示,二者有较高的相关性,相关系数r=0.9。在rgg基因敲除后,突变体05ZYH33△rgg的生长状态和毒力表型并没有发生变化,这并不表示rgg对代谢相关基因和毒力因子没有调节作用。相反,基因表达谱实验证实 rgg是一个全局转录调控因子,它对代谢相关基因和毒力因子的调控既有上调作用又有下调作用。如毒力因子SSU05_1982表达上调,而毒力因子SSU05_0196表达下调。这些相反的调控作用相互叠加和替代,最终相互抵消,使突变体的生长状态和毒力没有发生本质的变化。与第一部分黏附实验的结果相一致,在突变体05ZYH33△rgg中,与黏附相关的大量基因,如SSU05_0272、SSU05_1083、SSU05_1664、SSU05_1815等都表达下调。虽然,Rgg对SS2的黏附能力起着重要作用,敲除rgg基因后突变体05ZYH33△rgg对上皮细胞的黏附能力显著降低,但却并没有影响SS2的毒力。这可能是因为黏附作用只是SS2致病的众多条件之一,对SS2的致病性不起决定性作用。由此可见,Rgg对SS2基因组的调控作用十分复杂而又不影响毒力。　　本研究第三部分进行了野生株和敲除株的比较蛋白质组学研究。在相同条件下培养野生株和敲除株,用TCA-丙酮沉淀法分别提取了二者的细胞壁和分泌蛋白用于比较蛋白质学组研究,结果显示大部分细胞壁蛋白表达上调,而大部分分泌蛋白则表达下调。其中,与黏附相关的蛋白SSU05_0272、SSU05_1664表达下调,这与细胞黏附实验和基因表达谱实验结果相吻合。　　本研究第四部分以05ZYH33为模板克隆了全长为864bp的rgg基因,并将其定向克隆至pQE30载体,转化入BL21表达菌株,成功表达出Rgg蛋白。这部分研究为下一步用凝胶阻滞实验确定哪些基因直接受Rgg调控提供基础。　　本研究初步从基因表达层面和蛋白表达层面上了解了Rgg对05ZYH33基因组的调控作用,为研究Rgg蛋白与被调节基因的相互作用以及Rgg蛋白家族的结构和功能提供了依据。丰富了对S.suis中转录因子调控作用的认识,为了解猪链球菌的致病性提供线索。