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目的:
建立骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)体外分离纯化的方法，探讨联合应用肝细胞生长因子(hepatocytegrowth factor,HGF)和粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)诱导BM-MSCs分化为肝样细胞的可行性。
方法:
1、BM-MSCs分离、纯化：无菌条件下抽取2周龄SPF级SD大鼠股骨和胫骨的骨髓细胞，根据BM-MSCs与其他细胞贴壁性的差异，通过换液、传代达到分离纯化细胞目的；
2、BM-MSCs的鉴定：从细胞贴壁性、免疫表型检测(CD14、CD34、CD90)及分化为脂肪细胞三方面进行细胞；
3、BM-MSCs向肝样细胞分化：(1)实验分组：①G0组：不添加任何因子，设立阴性对照；②G1组：20ng/ml HGF，阳性对照组；③G2组：20ng/ml HGF+5ng/mlG-CSF；④G3组：20ng/ml HGF+10ng/ml G-CSF；⑤G4组：20ng/ml HGF+20ng/mlG-CSF；(2)诱导分化：取P5细胞，待其90％融合后，胰酶消化，调整细胞密度为2x105/ml，按实验分组接种于6孔板中，每隔3天换液一次；(3)肝样细胞鉴定：①细胞功能检测：选取诱导第7、14天的细胞进行PAS染色，检测糖原合成、分泌情况；②细胞标记物检测：选取诱导第7、14、21天的细胞，提取RNA，RT-PCR半定量检测AFP mRNA和ALB mRNA的表达水平。
4、统计学数据均用均数士标准差(x±s)表示，采用SPSS13.0软件处理，方法是单因素方差分析和q检验法，检验标准α=0.05。
结论:
1、差速贴壁法可以获得活力好、纯度高的BM-MSCs；
2、体外应用HGF和G-CSF能诱导BM-MSCs分化为表达AFP、ALB以及合成分泌糖原的肝样细胞；
3、G-CSF在成肝诱导方面具有协同作用，联合HGF和适宜浓度的G-CSF比单用HGF更有效地诱导BM-MSCs分化为肝样细胞。