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背景在中国,由于经济与社会的发展及进步,人们的生活水平日益提高,动脉粥样硬化性疾病发病率、致残率及死亡率均逐年升高。动脉粥样硬化性疾病的重要疾病之一冠心病(Coronary Heart Disease,CHD),已成为危害人类健康的重要疾病,急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,AMI)的再灌注治疗中急诊进行经皮冠状动脉介入治疗(Pereutaneous Coronary Intervention,PCI)是重要的治疗方法之一,挽救了许多患者的生命。近几年,通过有效地再灌注治疗,明显提高了罪犯血管开通率,尽管如此,成功进行急诊PCI后有5%-50%的患者已达到良好的心外膜冠状动脉灌注,但仍存在心肌灌注不良,其中有13%-40%患者可发生无复流(No Reflow,NR)或慢血流(Slow Reflow)现象。NR现象是AMI再灌注治疗的严重并发症之一,改善微循环状态,恢复持续有效的心肌功能改善已成为临床亟待解决的问题之一。目前,对于NR现象的研究尚未能明确解释其发病机制,分子生物学方面的相关研究发现,造成NR现象发生的机制有:组织因子和组织因子途径抑制物比例失衡,导致心肌细胞及血管内皮细胞的缺血性损伤、凝血与抗凝血机制紊乱、微血栓形成、微血管的痉挛和阻塞、中性粒细胞集聚、自由基的解离、炎症和炎症因子释放造成抗炎及促炎功能紊乱,进一步加重其相互作用,促进级联放大反应的结果。其中,在NR现象发生过程中血管内皮细胞的功能失调和损伤起了至关重要的作用。血管性血友病因子(Von Willebrand Factor,vWF)是一种具有极强的黏附功能的糖蛋白,主要由血管内皮细胞和巨核细胞合成并储存于内皮细胞Wellel-Palade小体内,释放入血后起到止血作用。目前,关于vWF在AMI再灌注NR现象的研究尚少,有研究发现vWF与血管内皮损伤有关,机制尚不清楚,可能与以下方面相关:(1)当血管内皮细胞受损伤时,vWF即可释放入血液循环并可介导血小板黏附于内皮下胶原纤维成分中,从而激活血小板、刺激血管壁平滑肌细胞的增生,进一步加重血管管腔狭窄的程度。(2)受损的内皮细胞可使vWF迅速黏附并作为Ⅷ:C的载体蛋白而发挥作用,该复合物的形成可成为促进血栓形成的重要影响因子,进而加重AMI后再灌注NR现象的发生。因此,探讨vWF对心梗后NR的潜在的机制及影响尤为重要。实验目的1.探讨无创性经口腔气管插管法制作小鼠AMI后再灌注NR模型方法是否可靠。2.探讨vWF表达情况在mRNA及蛋白水平与小鼠AMI后再灌注NR现象的相关性。研究方法1.选取野生型小鼠56只作为研究对象,其中正常组(normal组)小鼠12只,假手术组(Sham组)及无复流组(NR组),每组各22只小鼠。制作小鼠AMI再灌注模型,记录手术中心电图变化;行伊文思蓝(Evans Blue)、氯化三苯四氮唑(Triphenylt etrazolium Chloride,TTC)染色证实缺血及心肌梗死面积;行硫磺素S(Thioflavine S)染色证实NR模型构建成功并记录NR常见部位。在成功构建模型的基础上,进行vWF对AMI再灌注NR现象影响的相关研究。2.应用免疫组织化学染色方法(Immumohistochemical Staining)检测正常组(normal组)、Sham组、NR组中各组NR以上区域、NR区域、NR以下区域中vWF表达情况;3.应用蛋白免疫印迹(Western blot)检测并记录各组NR部位vWF蛋白表达;4.采用实时定量逆转录聚合酶链反应(quantitative real-time,RT-PCR)检测各组NR部位相应mRNA表达水平。结果1.通过行伊文思蓝-TTC染色并记录心电图改变证实缺血及心肌梗死模型制备成功;行硫磺素S染色证实小鼠AMI后再灌注NR模型制备成功;NR部位集中在结扎线以下1-3mm的左心室前壁,前降支供血区内;应用无创性经口腔气管插管法制作小鼠心肌梗死再灌注NR模型可靠。2.行免疫组化染色可见NR以上区域中normal组表达量较Sham组及NR组明显增加,差异有显著统计学意义(P<0.01),其中,NR组较Sham组相比,vWF表达量增加,差异有统计学意义(P<0.05)(图6);NR区域免疫组化染色阳性部位图像进行分析后可见:NR组较normal组及Sham组vWF表达量均增加(P<0.05),其中Sham组vWF表达量较normal组增加,差异有统计学意义(P<0.05)(图7);对于NR以下区域阳染图像分析后所见:Sham组vWF表达量较normal组、NR组增加,未见明显统计学差异(P>0.05)。3.vWF在NR部位mRNA水平表达:与normal组及Sham组相比NR组NR区域中vWF的mRNA表达量增加,但未见明显统计学差异(P>0.05)。4.vWF在NR部位蛋白水平表达:与normal组及Sham组相比,NR组NR部位中vWF蛋白表达量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.经无创性经口腔气管插管法制作小鼠AMI后再灌注NR模型方法可靠。2.在AMI后再灌注NR现象发生过程中血管内皮细胞损伤、炎症反应激活、微循环功能障碍等方面促使vWF表达增加,并作用于受损的血管内皮细胞可促进微血栓形成,加重微循环功能障碍,导致AMI后再灌注NR现象的发生。因此,如何有效的抑制AMI再灌注治疗术后vWF表达可能成为治疗NR现象的新靶点。