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第一部分PDAC组织中BC043614的表达及临床意义研究研究背景胰导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是死亡率极高的恶性肿瘤之一,全球范围内,其死亡率分别居男性癌症第八位和女性癌症的第九位。虽然近年来在早期发现和癌症治疗方面取得的进展使得PDAC死亡率有一定程度下降,但作为一种异质性极其复杂的疾病,PDAC仍然是一个重要的的公共卫生问题。由PDAC引起的高死亡率归因于在疾病转移到其他器官之前未能及时诊断疾病,以及癌细胞对目前治疗方法的耐受。PDAC进展是由多种遗传和表观遗传改变引起的,这些改变激活了细胞的各种畸变和出现肿瘤细胞的各种特征。畸变的积累促进细胞恶性转化并赋予其肿瘤表型。长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lnc RNAs)这一类新的基因表达的调控分子作为遗传和表观遗传失调的原因之一,最近得到了广泛的关注。本课题应用GEO大数据结合临床样本进行分析,筛选在PDAC中显著差异表达的lnc RNA,判断其临床表达意义。研究方法本研究对GEO数据(GSE16515和GSE32688)进行分析,挑选其中显著差异表达的lnc RNA-BC043614在我们收集的胰腺癌组织中进一步验证其表达;采用卡方检验和Pearson相关性分析对BC043614表达与临床病理参数的相关性进行统计学分析;采用Kaplan-Meier生存函数(Log rank检验)及Cox回归分析研究BC043614表达对PDAC患者的总生存时间(Overall survival,OS)的预测价值。研究结果GEO数据分析显示有24个lnc RNA在PDAC中差异表达,其中lnc RNA-BC043614在PDAC组织中高表达最为显著;随后RT-q PCR结果证实,其在42对PDAC组织中表达显著高于正常胰腺组织(P<0.01);在进展期,肿瘤大小>2cm,和发生淋巴结转移的PDAC组织中表达显著高于早期(P=0.0119),肿瘤大小≤2cm(P=0.0176)和未发生淋巴结转移(P=0.0099)的PDAC组织;卡方分析结果表明BC043614的表达与CA19-9、肿瘤直径、肿瘤分化程度、有无脉管癌栓相关,差异有统计学意义(P<0.05),与性别、年龄、肿瘤的部位无关;Kaplan-Meier生存曲线显示BC043614高表达组的患者其OS显著低于低表达组(P<0.01);单因素和多因素COX回归分析显示lnc RNA-BC043614表达(P=0.010)是影响PDAC预后的独立因素。研究结论通过GEO数据库胰腺癌lnc RNA表达数据分析,筛选出在PDAC中显著差异表达lnc RNA-BC043614,进一步临床样本验证结果表明BC043614在PDAC中高表达且与多项临床病理参数及预后显著相关。BC043614可作为临床病理监测PDAC进展并预测肿瘤患者预后的一个重要的参考指标。第二部分BC043614在PDAC中的功能研究研究背景lnc RNA与许多生物过程有关,例如选择性剪接、蛋白质活性的调节、蛋白质定位的交替以及表观遗传调节(DNA甲基化,染色质重构,组蛋白修饰和基因沉默),是一类在肿瘤中广泛发挥作用的调控分子。既往研究表明lnc RNA-BC043614可调控多种肿瘤细胞的恶性表型,但其在PDAC中的上调是PDAC恶性发展的促进因素还是只是一种单纯的伴随现象,其是否可以促进PDAC恶性表型?其具体功能如何?尚不清楚。阐明BC043614在PDAC中的生物学功能有助于明确其对PDAC的影响及未来的临床靶向治疗价值。研究方法利用载体构建、基因克隆?RNA干扰?瞬时转染等手段,在PDAC细胞株中过表达或敲减BC043614表达水平;应用CCK-8实验结观察BC043614对PDAC细胞增殖能力的影响;采用流式细胞学技术检测BC043614对PDAC细胞凋亡的影响;采用Transwell小室实验观察BC043614对PDAC细胞侵袭和迁移能力的影响。研究结果检测6种PDAC细胞株及正常胰腺导管上皮细胞中BC043614的相对表达水平,证实BC043614在PDAC细胞株中相对表达水平显著高于正常人胰腺导管上皮细胞株(P<0.05),通过在PDAC细胞株中进行的CCK-8实验,我们发现过表达BC043614可显著增强肿瘤细胞的增殖能力(P<0.05),敲减BC043614后肿瘤细胞增殖则明显受阻(P<0.05);流式细胞学技术结果表明过表达BC043614可显著降低肿瘤细胞的凋亡率(P<0.05),而敲减BC043614后促进了肿瘤细胞的凋亡(P<0.05)。transwell实验提示过表达BC043614可显著促进PDAC细胞的侵袭和迁移能力(P<0.05),敲减BC043614后肿瘤细胞迁移及侵袭能力则明显被抑制(P<0.05)。研究结论体外实验表明BC043614可促进PDAC细胞的增殖?迁移和转移能力,抑制PDAC细胞凋亡,促进PDAC恶性进程。BC043614在PDAC中的上调是PDAC癌恶性行为的促进因素而非伴随现象,BC043614在PDAC中发挥功能的具体下游分子机制有待阐明。第三部分BC043614下游靶分子的筛选与鉴定研究背景一个lnc RNA在肿瘤发生发展进程中可具有多种作用模式,BC043614分子通过多途径多机制参与肿瘤的发生发展,已知BC043614可通过调控Wnt/β-catenin、Rho A/Rac2和PTEN/p-AKT信号通路发挥作用,也可通过順式和反式作用影响基因转录。但BC043614在PDAC中作用机制尚未阐明。研究方法采用Targetscan 7.0、DIANA和micro RNA.org数据库结合TCGA大数据中mi RNA的表达筛选在PDAC中低表达并可与BC043614结合的mi RNA;采用RT-q PCR对PDAC组织和细胞中检测mi R-133a的表达,检测BC043614对mi R-133a表达的影响;利用Spearman分析对PDAC组织中BC043614与mi R-133a和IGF1R表达的相关性进行分析;利用荧光素酶实验检测mi R-133a与BC043614互补结合;利用回复实验检测PDAC中lnc RNA-BC043614是否参与mi R-133a对IGF1R表达的调控。研究结果采用Targetscan 7.0、DIANA和micro RNA.org数据库结合TCGA大数据中mi RNA的表达筛选在PDAC中低表达并可与BC043614结合的mi RNA,发现BC043614与mi R-133a存在结合位点;采用RT-q PCR2对PDAC组织和细胞中检测mi R-133a表达,发现mi R-133a在42对胰腺癌组织中表达显著低于正常胰腺组织(P<0.01),在PDAC细胞株中相对表达水平显著低于正常人胰腺导管上皮细胞株(P<0.05);RT-q PCR结果表明,过表达BC043614可显著降低mi R-133a表达,敲减BC043614可显著促进mi R-133a表达;利用Spearman分析对PDAC组织中BC043614与mi R-133a表达的相关性进行分析,发现BC043614与mi R-133a表达呈显著负相关;荧光素酶实验结果表明,mi R-133a可与BC043614互补结合调控BC043614的表达。进一步,我们发现mi R-133a inhibitor对IGF1R的促进作用被敲减BC043614补偿,mi R-133a对靶基因的抑制作用被过表达BC043614解除;且IGF1R在PDAC肿瘤组织中显著高表达,其表达与BC043614显著正相关用。CCK-8和Transwell小室实验检测结果表明在BC043614敲减PDAC细胞株中敲减mi R-133a可回复BC043614下调对细胞增殖和迁移侵袭的抑制作用(P<0.05);流式细胞学实验结果提示在BC043614敲减PDAC细胞株中敲减mi R-133a可回复BC043614下调对细胞凋亡的抑制作用(P<0.01)。证实PDAC中lnc RNA-BC043614通过mi R-133a调控靶基因IGF1R表达,在PDAC中发挥促癌作用。研究结论在PDAC细胞中,BC043614可通过与mi R-133a互补结合,调控mi R-133a靶基因IGF1R表达,在PDAC中发挥促癌作用。PDAC中存在BC043614-mi R-133a-IGF1R-肿瘤发生发展相关信号通路,未来可能作为重要的靶向药物研究方向。