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棉花是世界范围内重要的经济作物和油料作物,它不仅能为人类提供优质的天然棉纤维,而且棉籽中富含油脂、维生素、蛋白质和矿质元素等天然营养物质,因此具有广阔的开发应用前景。棉酚广泛存在于植株各组织器官,它对人类以及单胃动物有很高的毒性,这直接限制了人类对棉籽的充分利用。棉酚是一种重要的天然植保素,能增强植株对不良环境的抵抗和适应能力。澳洲棉具有"子叶色素腺体延缓形成"的特性,其休眠的种子中不存在腺体和棉酚,只有种子萌发后才会逐渐形成腺体和棉酚。杜松烯合酶是催化法呢基焦磷酸形成棉酚前体物质（+）-δ-杜松烯的关键酶,这是棉酚合成途径中的限速反应步骤,杜松烯合酶基因（Cdn）是植物萜类合酶基因家族中较大的家族之一,具有十分相似的总体结构,6个内含子位置相对保守。本实验室对澳洲棉和亚洲棉（江陵中棉）种子萌发时期进行转录组测序分析,并对两种棉花的杜松烯合酶基因（comp78894clseql）（Cdn）定量发现,其呈现出相反的表达模式:在澳洲棉中呈现递增趋势,在亚洲棉（江陵中棉）中呈现递减趋势;组织表达检测发现,该基因在根中的表达量显著高于茎叶。因此,我们认为该酶对棉花幼苗期体内棉酚的合成起重要作用。但是关于杜松烯合酶基因在棉花幼苗期表达调控机制鲜有报道。因此,本研究分别从澳洲棉和亚洲棉（江陵中棉）中克隆了 1个杜松烯合酶基因及其启动子,利用VIGS系统处理棉花幼苗以初步验证该基因的功能;并对启动子缺失载体进行瞬时表达,系统分别对基因及启动子功能进行初步鉴定,随后使用植物激素进行诱导处理,这将为进一步研究杜松烯合酶基因的调控机制,阐明棉酚的生物合成途径奠定基础。本研究从澳洲棉和亚洲棉（江陵中棉）这两个棉种中分别克隆到1个杜松烯合酶基因GauCdn和GarCdn,其gDNA序列长度分别为2863bp和2846bp,cDNA序列长度分别为1776bp和1814bp。基因结构分析发现,它们均含有7个外显子、6个内含子,ORF全长均为1665bp,编码554个氨基酸。氨基酸序列分析表明,它们都具有萜类合成酶典型的DDxxD和RR（x）8W保守结构域,而且在DDxxD结构域上游35个氨基酸残基的区域,还含有一个保守性很高的RxR结构域。系统进化分析表明,这两个Cdn基因均属于Cdn1-C亚家族。跨膜结构域预测显示,它们均不含有跨膜信号肽,可能属于非膜蛋白。理化性质分析表明,GauCdn基因蛋白分子式为C2865H4411N759O862S24,分子量为64.05KDa,等电点为5.22,是酸性蛋白;该蛋白带有负电残基（Asp+Glu）总数为85,正电残基（Arg+Lys）总数为63,属于不稳定蛋白,不稳定系数为45.34;亲水性系数为-0.433,脂肪系数为82.04,因此预测该蛋白为疏水性蛋白。GarCdn基因蛋白分子式为C2872H4424N762O856S24,分子量为64.09KDa,等电点为5.41,是酸性蛋白;该蛋白带有负电残基（Asp+Glu）总数为83,正电残基（Arg+Lys）总数为65,属于不稳定蛋白,不稳定系数为46.57;亲水性系数为-0.425,脂肪系数为82.40,因此预测该蛋白同样为疏水性蛋白。利用病毒诱导的基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）技术验证Cdn基因的功能。VIGS结果显示,沉默植株的Cdn基因表达水平和棉酚含量均显著低于对照植株;植株叶片的棉酚含量与Cdn基因mRNA表达水平呈现出相同趋势,证实了Cdn为控制棉酚合成的关键基因。为了研究杜松烯合酶基因的调控机制,我们分别克隆了它们的启动子GauCdn-P和GarCdn-P,序列长度分别为2626bp和2455bp。启动子序列分析表明,它们的序列差异较大,相似度仅为40%;A/T含量分别是59.86%和75.19%符合真核生物启动子序列特征。生物信息学分析显示,启动子GauCdn-P的核心启动区域为-48bp～+2bp,转录起始位点位于-8bp处的C碱基;启动子GarCdn-P的核心启动区域为-64bp～-113bp,转录起始位点位于-73bp处的C碱基。分别对2个Cdn基因启动子进行顺式作用元件预测分析发现,它们均含有TATA-Box和CAAT-Box等典型的真核生物基础启动子所必有的表达调控元件。启动子GauCdn-P序列中还存在多种激素诱导元件,如水杨酸应答元件TCA-element、茉莉酸甲醋应答元件CGTCA-motif、脱落酸响应元件ABRE、生长素响应元件TGA-element、赤霉素响应元件P-box和GARE-motif。此外,启动子GauCdn-P还含有ARE、LTR、MBS、Circadian、CCAAT-box等顺式调控元件。启动子GarCdn-P序列中也同样存在多种激素应答元件,如水杨酸应答元件TCA-element、脱落酸响应元件ABRE、乙烯应答元件ERE、赤霉素应答元件GARE-motif。此外,还有 ARE、CAT-box、MBS、Skn-1、RY-element 以及大量光响应元件存在于启动子GarCdn-P序列中。我们构建了启动子缺失表达载体进行烟草瞬时表达,以进一步研究启动子受激素诱导情况及激素应答元件所存在的区域。GUS活性检测结果显示:MeJA和SA能够极显著增强GauCdn-P活性,应答元件分别位于启动子-500bp～-276bp和-276bp～-7bp区域内;ABA能够显著增强GauCdn-P活性,响应元件存在于启动子-1806bp～-1491bp区域内。SA能够极显著提高GarCdn-P活性,并且在启动子-594bp～-12bp区域内很可能存在多个SA应答元件;ABA能够显著提高GarCdn-P活性,并且在启动子-1475 bp～-1008bp区域内含有ABA响应元件。这说明Gdn基因能够受多种激素诱导表达。