论文部分内容阅读
哺乳动物卵母细胞的体外成熟是核移植、转基因动物等胚胎工程技术的基础和关键技术环节之一。虽然卵母细胞的体外成熟技术研究已经取得了长足进展,但由于卵母细胞体内外生长发育的生理环境不同,导致卵母细胞的体外成熟效率远低于体内成熟。CK1是细胞有丝分裂和Wnt/β-catenin信号通路中的关键激酶,影响细胞的增殖分化。本研究探讨了 CK1的抑制剂D4476对牛卵母细胞体外成熟效率的影响及其作用机制,以便为完善牛卵母细胞体外成熟培养体系提供理论依据。首先,探讨了 D4476对牛COCs的卵丘细胞扩展、体外成熟及其随后胚胎发育潜能的影响。黄牛COCs经含不同浓度D4476(0、2、5、10、20μmol/L)的成熟培养液培养 24h后,2μmol/L 和 5μmol/L D4476处理组的卵丘细胞扩展平均分值与对照组差异不显著(2.57、2.67vs2.68,P>0.05),而 10μmol/L、20μmol/LD4476 处理组的卵丘细胞扩展平均分值显著低于对照组(1.92、1.26 vs2.68,P<0.05);5 μmol/L和10 μmol/LD4476处理组的卵母细胞成熟率显著高于对照组(70.15%、73.94%vs 53.65%,P<0.05),2μmol/L 和 20μmol/L D4476处理组的卵母细胞成熟率与对照组差异不显著(62.77%、67.85%vs 53.65%,P>0.05)。各成熟培养处理组的卵母细胞经体外受精后发现,2 μmol/L和5 μmol/L D4476处理组的卵母细胞体外受精分裂率与对照组差异不显著(70.90%、73.52%vs 69.43%,P>0.05),10 μmol/L和20 μmol/L D4476处理组的分裂率显著低于对照组(59.17%、48.57%vs69.43%,P<0.05);2μmol/L、5μmol/L和 10μmol/LD4476处理组的囊胚发育率显著高于对照组(20.05%、28.00%、19.72%vs 15.67%,P<0.05),20μmol/LD4476处理组的囊胚发育率与对照组差异不显著(14.71%vs 15.67%,P>0.05)。其次,探讨了 D4476影响牛卵母细胞体外成熟效率的作用机制。实时荧光定量PCR和PI染色检测分析发现,5 μmol/LD4476处理组的卵母细胞CK1表达量显著下降(P<0.05),但对卵母细胞核形态没有影响;Wnt信号相关基因β-catenin和Cx43表达无显著变化(P>0.05),TCF-4的表达显著提高(P<0.05)。5 μmol/LD4476处理组的卵丘细胞凋亡基因Bad表达无显著变化(P>0.05),Wnt信号相关基因β-catenin、Cx43和TCF-4,增殖基因CTSB和MAPK,扩展基因PTGS-2、PTX-3和TGS-6,凋亡基因Bax以及抗凋亡基因Bcl-2的表达显著升高(P<0.05)。Western Blot检测结果显示,5μmol/LD4476处理组的卵丘细胞Cx43蛋白表达在体外成熟过程中下降,在成熟后升高。以上结果表明,成熟培养液中添加5 μmol/LD4476能够提高黄牛卵母细胞体外成熟效率及其随后的胚胎发育能力,这一作用可能是D4476抑制了参与卵母细胞自发减数分裂的CK1的表达,提高核内转录辅助因子TCF-4的表达;同时,模拟Wnt信号,促进卵丘细胞的增殖、扩展,延缓卵丘细胞的凋亡而实现。