小菜蛾对菊酯的kdr抗性机制及抗性的分子检测方法研究

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本文对溴氰菊酯高抗小菜蛾品系从室内毒理、种群遗传学、生物化学和基因水平对其kdr抗性特性做了研究,旨在揭示小菜蛾对溴氰菊酯的kdr抗性机制及抗性的分子检测方法,从而为合理的使用菊酯类农药、延长其使用寿命及有效检测害虫kdr抗性的分子方法提供理论依据。通过比较萝卜苗与甘蓝叶片饲养小菜蛾的方法,改进和确定一套简便可行的室内饲养小菜蛾的方法。对采自北京、安徽、广西和海南田间小菜蛾用点滴法进行抗性监测,结果表明,田间小菜蛾对溴氰菊酯己产生高水平抗性,尤以海南抗性最高,抗性倍数在3570倍以上。利用群体选育与单对选育相结合的方法,选育溴氰菊酯抗性和敏感小菜蛾种群。溴氰菊酯群体汰选小菜蛾8次后,对溴氰菊酯的抗性>3500倍;经1代的单对反选育,相对敏感种群对溴氰菊酯的敏感性提高了2.6倍。通过溴氰菊酯抗性小菜蛾品系的交互抗性测定表明,对高效氯氰菊酯有很高的交互抗性,抗性倍数在1500倍以上,对DDT也产生了正交互抗性,但对有机磷与氨基甲酸酯类药剂辛硫磷和灭多威无正交互抗性。比较研究了多功能氧化酶抑制剂增效醚(PB)和酯酶抑制剂S,S,S-三丁基磷酸三硫酯(DEF)对溴氰菊酯抗性小菜蛾品系的增效作用。结果表明,PB对抗性品系有增效作用,但不能完全消除抗性品系对拟除虫菊酯的抗性;而DEF对几个菊酯及DDT增效作用不明显。说明小菜蛾对拟除虫菊酯的抗性与酯酶无关,与多功能氧化酶活性有密切关系,但不是唯一的抗性机制。用遗传学方法研究了小菜蛾对溴氰菊酯抗性的遗传方式。结果表明,小菜蛾对溴氰菊酯的抗性是由常染色体控制的不完全隐性遗传。依据已报道相关引物设计,用RT-PCR、nest-PCR扩增小菜蛾品系para型钠通道的区域Ⅱ的保守序列,研究小菜蛾的kdr抗性的分子机制。扩增出溴氰菊酯抗性小菜蛾para型钠通道314bp片段,其核苷酸序列与敏感品系同源性为98.7%,推导的氨基酸序列的同源性为92.2%,与果蝇para、家蝇的氨基酸序列的同源性分别为96.2%和93.3%。与敏感小菜蛾核苷酸序列比较,抗性小菜蛾核苷酸序列包含四个基本的变化。其中两个突变与家蝇和德国蜚蠊的突变一致,一个位于第1014位的IIS6,从敏感品系的亮氨酸(CTT)到抗性品系的苯丙氨酸(TTT)的替换(L1014F),一个位于IⅡS4-S5连接环上,从甲硫氨酸(ATG)到苏氨酸(ACG)的突变(M918T),这是在小菜蛾中首次发现的与super-kdr抗性相关的突变。第三个突变位于ⅡS5,与super-kdr家蝇品系不同,是从苏氨酸(ACC)到异亮氨酸(ATC)的突变(T929I)。第四个新突变位于IIS6,从敏感品系的苯丙氨酸(TTC)到抗性品系的亮氨酸(TTA)的替换(F1020L)。从毒理、种群遗传学、生物化学和基因水平等结果与害虫kdr抗性特性的一致性表明小菜蛾对溴氰菊酯的kdr抗性机制的重要作用。依据钠通道保守序列及L1014F、T929I点突变设计5对不同引物,用PASA、Bi-PASA和SSCP分子检测技术,检测抗性和田间小菜蛾kdr抗性不同基因型,研究小菜蛾kdr抗性分子检测方法。结果表明,小菜蛾抗性RR、敏感SS和杂合RS品系在PASA、Bi-PASA和SSCP分子检测中分别呈现不同的带型图样,PASA、Bi-PASA和SSCP分子检测技术能有效的区分小菜蛾RR、SS和RS品系,灵敏度较高。
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