在发达国家,建立一个有效的治疗血管缺血的治疗方法,是一项具有挑战性的研究。研究至今,人们创立了一些治疗方法,比如给予一些生长因子或给予一些骨髓来源细胞的治疗,然而结果不是十分令人满意。1-磷酸鞘氨醇(S1P)是一种具有重要生物学活性的溶血磷脂,主要来源于细胞膜鞘磷脂的分解代谢,参与S1P生物合成调节的酶主要为鞘磷脂酶,神经酰胺酶,鞘胺醇激酶和S1P裂解酶。现在人们已经发现S1P作用于5种S1P受体:S1P1,S1P2,S1P3,S1P4和S1P5。一些机制研究表明S1P1受体和S1P3受体通过Gi来上调Rac引起细胞的趋化作用,S1P2受体通过G12/13来激活Rho,从而下调Rac,进而抑制了细胞的趋化作用。S1P1和S1P3表达在内皮细胞,S1P2和SlP3表达于平滑肌细胞,S1P作用于血管内皮细胞以及平滑肌细胞,从而刺激细胞迁移和血管形成,以及在发育血管新生中起着重要的作用。S1P信号通路参与了以下的生理功能:血管和神经的发育,淋巴细胞再循环,维持内皮功能,内耳功能和蜕膜形成。一些体内外实验表明了S1P对血管新生的作用:体外实验表明S1P可以刺激内皮细胞的迁移和增殖、刺激管腔形成;体内实验表明S1P可以刺激植入的基质胶发生血管新生、S1P1基因敲除鼠表现为血管成熟受损以及胚胎期死亡。因此我们研发了以聚乳酸乙醇酸共聚物包被的1-磷酸鞘氨醇微粒(PLGA-S1P),这种微粒是可以生物降解的并且可以持续释放1-磷酸鞘氨醇,并且研究了PLGA-S1P微粒对于小鼠下肢缺血模型的新生血管生成的作用。　　 方法：首先制备PLGA微粒以及小鼠下肢缺血模型;比较了3种不同的给药间隔时间,如一次给药,每隔6日给药和每隔3日给药对于小鼠下肢缺血模型的新生血管生成的作用,在这3种给药方式中,总的S1P量一致。我们还比较了4种不同药物浓度对血流恢复的作用;VEGF和PLGA-S1P对小鼠缺血下肢血流恢复的作用;通过二重免疫荧光染色、检测血管生长因子mRNA表达水平、Akt和ERK的磷酸化,以及内皮一氧化氮合酶的磷酸化水平;给予eNOS抑制剂;骨髓移植实验;免疫组化检测。　　 结果：　　 1、研究结果显示3日一次肌内注射PLGA-S1P与一次性肌内注射或每6日一次肌内注射相比,为最佳给药间隔。　　 2、在术后28天PLGA-S1P剂量依赖性的刺激C57BL/6小鼠缺血下肢的血流恢复。Balb/c小鼠通常在股动脉结扎后表现为由于血流恢复缓慢而导致的下肢坏死和运动功能不良,注射PLGA-S1P可以刺激缺血下肢的血流恢复以及减轻缺血下肢的坏死和减轻运动功能不良。　　 3、由于局部注射血管内皮生长因子(VEGF)可以导致血管通透性增高,进而引起组织水肿,从而限制了其在临床上的应用,因此我们比较了VEGF和PLGA-S1P对小鼠缺血下肢血流恢复的作用,研究结果表明单独应用PLGA-S1P不但没有引起缺血下肢的水肿,反而可以抑制由VEGF导致的组织水肿。　　 4、二重免疫荧光染色结果表明,局部注射PLGA-S1P不仅可以增加缺血肌肉的微血管密度、促进大血管的形成,还可以促进周细胞和平滑肌细胞对新生血管的包被,因此增加了新生血管的稳定性,抑制新生血管的退化。　　 5、我们发现下肢缺血可以增加白介素-1(IL-1)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子-1(TGF-1)、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)和血小板衍生生长因子-B(PDGF-B)的表达水平,而PLGA-S1P可以增加血管生成素-1(angiopoietin-1)、HGF、IL-1和SDF-1的表达水平。　　 6、我们研究了NOS在PLGA-S1P对下肢缺血动物模型新生血管形成的作用,一些体外实验表明在血管内皮细胞,S1P活化AKT来刺激eNOS是通过Akt介导的eNOS磷酸化;最近也有研究结果表明ERK1/2也是通过eNOS磷酸化来刺激eNOS的,eNOS活化必然导致NO产生,从而加速下肢缺血动物模型的血流恢复情况,实验结果表明局部注射PLGA-S1P可以刺激缺血肌肉组织的蛋白激酶Akt和ERK的磷酸化,以及内皮一氧化氮合酶的磷酸化。　　 7、为了进一步验证eNOS对小鼠缺血模型血流恢复的作用,我们全身给与Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME),eNOS抑制剂,研究结果显示L-NAME可以降低PLGA-S1P刺激血流恢复的情况,同时免疫组化结果进一步表明:全身给与L-NAME,具有抑制PLGA-S1P刺激的血管内皮细胞阳性的微血管密度的趋势。　　 8、由于骨髓来源的细胞可以分泌一些生长因子以及分化为血管内皮细胞和周细胞,因此我们通过骨髓移植实验来观察PLGA-S1P对骨髓来源细胞的作用,我们可以看到PLGA-S1P可以诱导GFP阳性的骨髓来源细胞的浸润;免疫组化检测结果显示:PLGA-S1P可以增加下肢缺血组织CD45标记的全骨髓细胞的浸润,CDllB标记的单核系细胞浸润和Gr-1标记的中性粒细胞的浸润。　　 结论：上述数据表明了:　　 1、每隔3日局部给予PLGA-S1P可以促进C57BL/6小鼠下肢缺血模型的血流恢复,微血管数的增加以及促进血管成熟化;　　 2、每隔3日局部给予PLGA-S1P可以促进Balb/c小鼠下肢缺血模型的血流恢复,减少组织坏死,促进下肢的运动功能;　　 3、单独给与PLGA-S1P缓释微粒并未引起下肢水肿,并且可以抑制VEGF引起的组织水肿;　　 4、PLGA-S1P促进血管新生的机制是通过促进Akt和ERK磷酸化以及eNOS的磷酸化,上调一些生长因子的表达以及诱导骨髓来源细胞的聚集。　　 综上所述,局部注射PLGA-S1P缓释微粒对于刺激缺血后血管新生是一个非常有前景的治疗方法,可能会成为治疗血管新生的重要靶点。