子宫内膜癌是女性生殖道常见三大恶性肿瘤之一,约占女性癌瘤的7%,女性生殖道恶性肿瘤的20%～30%,近20年来发病率呈逐年上升趋势。美国癌症协会2014年的报告中显示,美国约有52,630名女性被新确诊为子宫恶性肿瘤,其中大部分是子宫内膜癌。尽管绝大多数子宫内膜癌病例呈偶发性,但仍有少部分病例表现出一定程度的基因遗传倾向。根据组织病理学特征,子宫内膜癌被分为子宫内膜样癌、浆液性癌、透明细胞癌、粘液性癌、神经内分泌癌、未分化癌和癌肉瘤。其中,最常见的两种类型是子宫内膜样癌(endometrioid endometrial carcinoma, EEC)和子宫内膜浆液性癌(serous endometrial carcinoma, ESC),各占子宫内膜癌的80～90%和2%-10%。近年来,二元分类法被引入子宫内膜癌的分类分型。在此分类方法中,依据不同的流行病学特点、临床特征、组织学特征和分子改变,子宫内膜癌分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型子宫内膜癌主要以EEC为主(80-90%),少部分为粘液性癌；Ⅱ型则包括ESC、透明细胞癌、未分化癌和癌肉瘤等,其中ESC占绝大多数。Ⅰ型子宫内膜癌起因于无对抗的雌激素刺激,多见于50岁左右的妇女,癌组织周围的子宫内膜呈现增生状态,预后较好。Ⅱ型子宫内膜癌与激素水平关系不大,多见于60多岁的老年女性,癌组织周围的子宫内膜常表现为静止状态。Ⅱ型子宫内膜癌恶性程度高,发现时期别较晚,相应地预后更差。在基因突变和分子改变方面,Ⅰ型子宫内膜癌表现为PTEN (80%)、β-catenin (30%)和K-ras (25%)等基因的突变,而Ⅱ型子宫内膜癌,尤其ESC,则表现为ER和PR缺失,TP53突变和HER2的表达扩增。随着研究的逐步深入,二元论模型分类法得到了越来越多临床资料和分子学证据的支持,以及研究者和临床工作者的认可。就发病过程而言,Ⅰ型子宫内膜癌现已明确。以子宫内膜样癌为例,子宫内膜在无对抗的雌激素的作用下增生过度,进而发生复杂性增生、不典型增生,直至发展为子宫内膜样癌。子宫内膜不典型增生被视为子宫内模样癌的癌前病变。然而,Ⅱ型子宫内膜癌的发生发展过程尚不明确。通过临床病理的观察,Zheng等人发现子宫内膜浆液性癌发生发展过程中经历了一个中间阶段,即子宫内膜异型增生(endometrial glandular dysplasia, EmGD)。此外,子宫内膜上皮内癌(endometrial intraepithelial carcinoma, EIC),即无浸润的早期癌,是另一特殊的病变阶段,处于EmGD和ESC之间。2011年,Zheng等人在ESC患者切除的子宫组织中发现一些形态正常的子宫内膜腺体细胞中高表达p53蛋白,并将其定义为p53印记(p53 signature)。并在同一部位甚至同一腺腔中观察到了p53印记、EmGD和EIC的同时存在。随后,Zheng等人提出了ESC可能的发生发展过程是“静止期子宫内膜→p53印记→EmGD→EIC→ESC’’的猜想,并推断EmGD可能是ESC的癌前病变阶段。动物模型通过模拟人的疾病发展过程,不仅可以发现某种疾病的演变过程和特点,更好地理解疾病发展。同时,还可为进一步研究疾病的治疗方法提供合适的实验对象,在疾病研究过程中的意义极其重要且不可取代。前期,我们进行了子宫内膜癌免疫相关的研究,发现T细胞亚群中的辅助性T细胞17 (Thelper 17 cell, Th17cell)、杀伤性T细胞17 (cytotoxicity T 17 cell, Tc17 cell)、调节性T (regulartory T)细胞在子宫内膜癌患者外周血和肿瘤局部均有显著升高。而进一步研究子宫内膜癌的免疫治疗,急需建立动物模型以提供研究的实验对象。转基因小鼠模型是最常用的动物模型。Ⅰ型子宫内膜癌小鼠模型现已有成功案例,一些包含有全身敲除或条件性敲除PTEN基因的小鼠大多能够成功模拟从子宫内膜单纯性增生,到复杂性不典型性增生,直至EEC的整个发生发展过程。然而,Ⅱ型子宫内膜癌模型发展相对滞后。本研究主要阐述小鼠模型的建立过程及模型准确性的判断,另对小鼠模型中发生的分子改变做了进一步分析。全文分为两部分：一、子宫内膜浆液性癌TP53基因敲除小鼠模型的建立二、子宫内膜浆液性癌TP53基因敲除小鼠模型的分子研究第一部分子宫内膜浆液性癌TP53基因敲除小鼠模型的建立研究背景和目的TP53突变是ESC基因分子水平上最显著的特征。据统计,接近90%的ESC病例其免疫组化结果发现有p53蛋白的高表达。并且子宫内膜癌及其早期病变中普遍存在着TP53基因的突变。在形态正常的子宫内膜腺细胞中发现有p53的高表达,被称为p53印记(p53 signature),现已被视为子宫内膜癌的早期诊断指标之一。研究显示,TP53突变随病变进展逐渐增多,p53印记、EmGD、EIC和ESC中TP53基因突变率分别为42%,43%,63%-72%和96%。此外,同一组织中不同病变阶段的TP53突变有30%以上是相同的。因此,TP53基因的突变对ESC的发生发展有重要作用,可能是肿瘤发生的驱动因素之一。Cre-loxP特异性重组酶系统是近年来应用最广泛的条件性基因重组方法,可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。若DNA序列位于两个loxP位点之间,在Cre重组酶的作用下即可发生缺失或倒转等序列重组。在何种组织细胞或器官中敲除某一特定的基因取决于所选择的启动子。选择合适的启动子调控Cre重组酶的表达,即可使其在生物体特定的部位、特定的条件下产生,实现相应条件下某一特定基因的敲除。Ksp-cadherin (Cadherin 16)是钙粘素家族中具有组织特异性的细胞粘附分子之一,能够在肾脏特异性表达,也可在未成熟的肾盂、中肾管和苗勒氏管中少量表达。Ksp 1.3-Cre是在体细胞中Ksp-cadherin启动子后插入一段Cre重组酶序列,从而在这些能够表达Ksp-cadherin的组织结构中表达Cre重组酶,相应地敲除这些组织中被loxp序列框夹的DNA序列。Ksp1.3-Cre转基因小鼠是由德克萨斯大学西南医学中心的Peter等人在2002年公开发表构建成功的。Shao等人对Ksp 1.3-Cre小鼠各组织器官表达Cre重组酶的情况作了比较详细的检测。通过免疫荧光及β-半乳糖苷酶染色显示Cre重组酶表达位置,结果显示在雌鼠的苗勒氏管,即子宫内膜腺上皮中有明显表达。故Ksp 1.3-Cre转基因小鼠可作子宫内膜癌转基因小鼠模型的工具鼠选择之一。鉴于1Ⅱ型子宫内膜癌与TP53的重要关系,以往大多数子宫内膜癌小鼠模型都是基于Trp53进行的。然而,这些模型虽都形成了多种类型的肿瘤。但由于小鼠寿命明显缩短,均未发现有子宫内膜癌。, Reardon等人同时敲除子宫内膜腺细胞的Cdh1和Trp53基因建立的小鼠模型在24周龄时即出现了Ⅱ型子宫内膜癌(未分化癌),而进一步研究结果显示,该模型中得发生机制多与基因敲除后引发的慢性炎症相关,且未见典型癌前病变EmGD和早期病灶EIC。本研究通过Cre-loxp条件性敲除系统,选取Ksp1.3启动子为Cre重组酶的组织特异性位点,特异性敲除小鼠子宫内膜腺细胞中TP53基因,使得具有重要抑癌作用的p53蛋白表达失活,从而建立能够呈现ESC完整发生发展过程的小鼠模型,进一步探究ESC的发病过程和机制。材料和方法本研究采用的工具小鼠分别是Trp53fl/fl和Ksp 1.3-Cre+/-。Trp53fl/fl是一组在其Trp53基因的第1内含子和第10内含子中各插入一段同方向性的loxp序列的转基因小鼠。Ksp 1.3-Cre+/-是一组Ksp 1.3启动子后加入Cre重组酶序列的转基因小鼠。将Trp53fl/fl小鼠和ksp 1.3-Cre小鼠进行杂交后,最终得到一组基因型为Trp53Δ/Δ (Ksp 1.3-Cre+/Trp53fl/fl)的实验组小鼠。Cre重组酶能在该实验组小鼠的泌尿生殖系统中普遍的表达,相应地在这些组织中敲除Trp53基因。另外,以同窝出生的基因型为Trp53fl/fl (WT, Trp53fl/fl)的小鼠作为正常对照。其中,实验组和对照组的小鼠以2：1的比例,对照组48只,实验组96只,自10周龄至80周龄,间隔2周处死。其中,10～30周龄和66～80周龄的小鼠对照组设1只,实验组设2只；32～64周龄考虑是早期病变发生最频繁的时期,故对照组设2只,实验组设4只。小鼠在相应周龄被处死后,其子宫、双侧卵巢和输卵管、双侧肾脏、膀胱等组织用4%中性甲醛溶液固定、石蜡包埋,制作成蜡块。每个蜡块以4微米的厚度连续切片十张,依次编号,将第一张和第十张进行HE染色,镜下排查相应组织的病变情况。采取蛋白酶K法溶解提取鼠尾DNA,基因型鉴定PCR反应产物以琼脂糖电泳明确各小鼠基因型。结果1.特异性敲除小鼠子宫内膜腺细胞中的TP53基因可成功诱导ESC。54周龄实验小鼠子宫内开始发现ESC,阳性率为50%(4例小鼠中发现2例存在ESC病变)。在66周龄及以上的小鼠子宫中,ESC的发生率升至100%。2.随周龄递增,观察到“RE→mGD→EIC→ESC"这一完整的发生发展过程。最早在12周龄的Trp53△/△小鼠的子宫中发现EmGD,在≥32周龄Trp53△/△小鼠的子宫中发现EIC。同时,在之54周龄Trp53△/△小鼠的子宫中发现ESC。并且,多种病变阶段可同时存在于同一子宫、甚至同一子宫组织切面的不同腺体中。3.在10～80周龄的所有实验组小鼠的卵巢、输卵管、肾脏和膀胱组织中,均未发现病变。由于实验组小鼠的Trp53敲除发生在泌尿生殖系统,故对卵巢、输卵管、肾脏和膀胱组织均做了相应的大体解剖和病理学检查,均未发现有肿瘤的产生。4.在10～80周龄的所有对照组小鼠的子宫、卵巢和输卵管、肾脏和膀胱中,均未发现相应病变。结论Tp53基因在ESC发生发展中有重要作用,特异性敲除小鼠子宫内膜腺细胞中的Trp53基因可导致子宫内膜浆液性癌的发生。该模型完整呈现了ESC的发生发展过程,首次在动物模型中证实子宫内膜浆液性癌存在EmGD的癌前病变阶段。第二部分子宫内膜浆液性癌TP53基因敲除小鼠模型的分子研究研究背景和目的基因突变和分子改变一直是肿瘤研究的重要方面。通过不同基因突变情况和不同分子表达情况,不仅可以获悉疾病发展的基因学病因,同时还可以根据分子表达的不同配伍,对一类恶性肿瘤进行病理学分类,从而更好地了解肿瘤的生物学特性,指导临床治疗。通过临床资料的不断积累和分子生物学的深入发展,证实Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌不仅在流行病学特征有所不同,更重要的是在基因突变和分子改变方面有明显的差异。研究发现,Ⅰ型子宫内膜癌,主要涉及抑癌基因PTEN的失活(50%-80%)、Vimentin表达升高(EEC中>60%)、fl-catenin(10～30% )和K-ras (20%)的突变。Ⅱ型子宫内膜癌,尤其ESC,主要表现为TP53的突变和HER2的表达扩增,其阳性率分别为90%和16～80%。同时,ER和PR也有显著的缺失,其表达率分别为<30%和<5%。此外,细胞间蛋白(例如E-cadherin和Claudin蛋白)和P16和IMP3的表达也发现在Ⅱ型子宫内膜癌中有不同程度的升高。IMP3是近几年发现的一个新的分子标记,在Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌中表达有明显差异。IMP3在ESC及其早期病变中有显著的高表达,现已被应用到ESC的鉴别和早期诊断。Zheng等人对正常子宫内膜、各型子宫内膜癌及其早期病变进行了比较全面的IMP3免疫组化染色分析。结果显示IMP3在ESC及其早期病变中有显著的高表达：14%(3/21)的EmGD病例,89%(16/18)的EIC病例以及94%(48/51)的ESC病例中均有IMP3的高表达。而其他类型的病例中IMP3的阳性表达率不超过33%,其中正常内膜全部为阴性。Mhawech-Fauceglia等人通过对子宫内膜癌病例的回溯性研究,ER(+)/PR(+)/IMP3(-)可作为EEC的诊断分子指标,而ESC则为ER(-)/PR(-)/IMP3(+),从而鉴别两种最常见的子宫内膜癌。Ksp 1.3,即Ksp-Cadherin,可表达产生Cdh16蛋白。Cdh16主要在胚胎前体结构以及成年鼠的泌尿生殖系统中表达,本研究部分拟利用Ksp-cadherin (Cadherin16)在组织结构中的特异性表达的特性,对实验组小鼠子宫和输卵管及卵巢组织进行免疫组化染色,以明确Trp53基因敲除的位置；对ESC几个相关的特征分子(ER,PR, Vimentin和IMP3)进行免疫组化染色分析,在分子水平上以进一步明确该模型作为子宫内膜浆液性癌模型的准确性；IMP3染色对ESC早期病变(EmGD和EIC)的评估以在分子水平上对EmGD的癌前病变角色进行初步的验证；此外,通过全基因组表达谱芯片技术,对实验组和对照组小鼠的子宫和卵巢组织进行检测,进一步核实Trp53基因在各组织结构中的表达,明确其敲除效果,同时检测在Trp53基因敲除的前提下,参与了ESC的发生发展过程的差异基因和信号转导通路。材料和方法实验组小鼠子宫、输卵管和卵巢组织行Cdh16免疫组化染色；免疫组化法评价ER.PR.vimentin.IMP3等分子在模型肿瘤中的表达情况；全基因组表达谱芯片技术对Trp53△/△和Trp53fl/fl小鼠子宫和输卵管及卵巢组织进行检测,行差异基因分析、Pathway分析和GO分析。结果1.Cdh16免疫组织化学染色示Cre重组酶表达位置实验组小鼠子宫和输卵管Cdhl6免疫组织化学染色,结果显示子宫内膜腺上皮细胞均有较强着色,输卵管上皮细胞有少部分轻着色,而卵巢上皮均未见着色。另外,芯片结果显示实验组小鼠子宫组织中Cdhl6基因表达明显高于输卵管和卵巢组织,pTrp53<0.001,Fold change=7.8,FDR=0.002)2.子宫内膜浆液性癌相关特征分子的表达情况本研究小鼠模型产生的肿瘤进行了相关分子的免疫组化结果示ER(20%～40%)、PR(<5%)、Vimentin(<5%)、IMP3(>90%),与人子宫内膜浆液性癌分子表达一致。分子表达与ESC一致。另外,实验组小鼠和对照组小鼠子宫组织行IMP3免疫组化染色,结果发现对照组小鼠子宫中IMP3阳性率<5%,而实验组小鼠子宫组织中正常内膜(+／-),EmGD和EIC均呈高表达,与本研究小鼠模型中产生的子宫内膜浆液性癌表达一致。3. mRNA芯片差异基因分析为明确Trp53实验组和对照组的输卵管及卵巢中的差异,取实验组和对照组的输卵管及卵巢组织各4例送检。倍数法筛选表达差异基因结果显示,实验组子宫组织中共有738个差异基因,其中210个基因表达上升,528个基因表达下降。其中,实验组子宫组织中的Trp53有明显的下调(pTrp53= 0.006, Fold change= 3.7, FDR= 0.005);在输卵管及卵巢组织中,未见有Trp53及其相关基因的表达改变(p>0.05)。进一步确认本研究Trp53基因敲除的位置在子宫内膜。Fold change为差异倍数,FDR为对显著性的再评价,p值<0.05且FDR<0.05视为差异表达。4.差异基因的生物功能分析——GO分析GO分析是利用GO数据库对芯片结果中显著靶向性功能的分析方法。对实验组子宫组织芯片筛选出的差异基因进行了GO分析,在生物学进程(Biological process)中,发现有203项上调,180项下调；在分子功能(Molecular function)中,有70项上调,77项下调；在分子组分(Cellular component)中,有38项上调,18项下调。5.差异基因参与的信号转导通路分析—-Pathway分析我们从信号转导通路水平进行了Pathway分析,结果显示,实验组子宫组织中,共有63个通路发生改变,其中22个通路上调,41个通路下调,如表5所示,显著性p值均<0.05。结论本研究小鼠模型Trp5-3特异性敲除的部位在子宫内膜。模型中相关分子表达与人子宫内膜浆液性癌的表达一致,证明了本模型的准确性,并在小鼠模型的分子水平验证了EmGD是子宫内膜浆液性癌的癌前病变。