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研究目的研究生物标志物P16、NF-κB/P65、FHIT、DNA-PKcs、Id2、EGFR及Her-2在结直肠癌的表达与肿瘤生物学特点并探讨上述标志物与患者无瘤生存时间和总体生存时间的关系。寻找新的与结直肠癌预后相关的分子标记物，以期为临床提供更多的信息，指导治疗，减少复发与转移。研究方法本实验为回顾性研究：复习解放军总医院病理科1993-2006年间根治性手术切除的结直肠癌558例，根据WHO结直肠癌病理分类标准，查阅相关病历，并对1993-2002年间结直肠癌手术患者共383例全部进行随访，其中成功获访的病人共312例。将所得到的临床资料与病理资料完整结合，最终选择出资料完整的结直肠癌实验标本共359例，其中有完整随访资料的共198例。组织芯片的制作：在组织芯片技术原理的支持下，结合实际情况并采取重复性的探索，摸索出一个简易可行的手工制作组织芯片的方法，并采用不锈钢针及薄铜板自制了一个组织芯片打孔模具，将石蜡包埋的359例结直肠癌及35例癌旁正常组织标本制作成7块组织芯片。免疫组化染色：采用PV6000二步法，检测7块组织芯片中359例结直肠癌及35例癌旁正常组织标本的P16、NF-κB/P65、FHIT、DNA-PKcs、Id2、EGFR及Her-2等七种生物标志物表达状况，分析其与临床、病理及预后的关系。EGFR基因突变的检测：提取25例结直肠癌石蜡标本的DNA，进行定量测定，并采用聚合酶链反应技术进行扩增反应，用扩增产物来进行纯化及测序分析，观察其EGFR基因第18、19、20及21外显子的突变情况。Western印迹杂交：对16例新鲜结直肠癌手术标本进行组织蛋白的提取及定量，并通过Western印迹杂交法比较结直肠癌组织与癌旁正常组织中DNA-PKcs蛋白表达的不同。结肠癌Colo205细胞的培养及荧光免疫细胞化学染色：采用细胞培养技术培养结肠癌Colo205细胞，通过制备Colo205细胞悬液，经Hoechst33342和PI染色、荧光免疫细胞化学染色等实验方法，在荧光显微镜下观察并计数SP细胞，分析其在P16、NF-κB/P65、FHIT、DNA-PKcs及Id2中表达的异同。结果各生物标志物的在结直肠癌表达的阳性率分别为P16 53.2％（191/359），NF-κB/P65 67.7％（243/359），FHIT 46.0％（165/359），DNA-PKcs 63.5％（228/359），Id2 68.0％（244/359），EGFR 64.9％（233/359），Her-21.7％（6/359）。与TNM分期相关的是DNA-PKcs、NF-κB/P65、P16、FHIT及Id2，其中DNA-PKcs、NF-κB/P65、P16及Id2的表达自临床分期Ⅰ期至Ⅳ期均为逐级增强（P均＜0.05），而FHIT则随着临床分期的增加其表达逐渐降低（P=0.000）。FHIT与肿瘤的肠壁浸润深度呈负相关，浸润于肌层的患者FHIT的阳性表达率要明显高于浸润于浆膜层/外膜的患者，而DNA-PKcs和Id2则与之相反（P均＜0.05）。DNA-PKcs、P16、NF-κB/P65、FHIT及Id2均与腹腔及远处转移相关，其中DNA-PKcs、P16、NF-κB/P65及Id2与腹腔及远处转移呈正相关，转移组的阳性率均明显高于末转移组的阳性率（P均＜0.05），而FHIT则与腹腔及远处转移呈负相关（r=-0.488，P=0.000），在转移组的阳性率为10.6％，未转移组的阳性率为62.1％。此外，DNA-PKcs、P16、NF-κB/P65、FHIT及Id2五者的表达均与患者是否伴有淋巴结转移相关，其中，DNA-PKcs、NF-κB/P65、P16、及Id2的阳性表达率在伴有淋巴结转移且数目较多的患者中比较高，而FHIT则与之相反（P均＜0.05）。DNA-PKcs、NF-κB/P65、EGFR及Id2在结直肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织，而FHIT则相反（P均＜0.05），P16和Her-2在癌和癌旁正常组织中表达的阳性率均无显著性差异（P均＞0.05）。单因素生存分析显示，DNA-PKcs、FHIT、NF-κB/P65、Id2、P16、患者发病年龄、TNM分期、淋巴结转移情况、肠壁浸润深度、腹腔及远处转移情况和术后是否进行放化疗等11种因素与结直肠癌患者的术后生存时间相关：P16、DNA-PKcs、NF-κB/P65及Id2阳性组患者的五年生存率均低于阴性组患者的五年生存率，而FHIT阳性组患者的五年生存率则显著高于阴性组患者的五年生存率（P均＜0.05）。P16及Id2阳性表达组患者的无瘤生存时间均较阴性表达组患者的无瘤生存时间短(PP16=0.015，PId2=0.002)，阳性表达组的平均无瘤生存时间分别为P16 53.0个月、Id2 57.0个月，阴性表达组的平均无瘤生存时间分别为P16 71.9个月、Id2 80.1个月。DNA-PKcs阳性表达组患者的无瘤生存时间和总体生存时间均短于阴性表达组患者(Pdfs=0.000，Pos=0.000)。NF-κB/P65阳性表达组患者的无瘤生存时间（53.1个月）较阴性表达组患者的无瘤生存时间（82.9个月）短（P=0.000），而FHIT阳性表达组患者的预后好于阴性表达组患者(Pdfs=0.000，Pos=0.000)。发病年龄在31至65岁之间的患者的平均无瘤生存时间（66.3个月）要长于年龄＞65岁（46.9个月）或年龄≤30岁的患者（63.6个月）（P=0.027）。TNM分期级别越高的患者无瘤生存时间越短（P=0.000）。肠周淋巴结受累与未受累的病例无瘤生存时间和总体生存时间均有显著性差异(Pdfs=0.000，Pos=0.000)。肿瘤组织侵及肠壁的深度与患者的无瘤生存时间有显著性差异（P=0.019），肿瘤组织浸润至肠壁肌层的患者其平均无瘤生存时间（93.1个月）长于肿瘤组织侵透肠壁全层的患者的平均无瘤生存时间（59.3个月）。术中没有发现有腹腔及远处转移的患者和术后及时采用放化疗等辅助治疗措施的患者其无瘤生存时间均比较长(P远处转移=0.000，P辅助治疗=0.000)。Cox多因素无瘤生存分析显示，NF-κB/P65、腹腔及远处转移情况以及术后是否采取放化疗等辅助治疗措施等3种因素入选，NF-κB/P65阴性表达、未发生腹腔和远处转移、术后及时采取放化疗等辅助治疗的患者无瘤生存时间长，预后较好。Cox多因素总体生存分析显示，NF-κB/P65、TNM分期、腹腔及远处转移情况以及术后是否采取放化疗等辅助治疗措施等4种因素入选，NF-κB/P65阴性表达、TNM分期级别低、未发生腹腔及远处转移、术后及时采取放化疗等辅助治疗的患者总体生存时间长，预后较好。在25例结直肠癌EGFR基因突变的检测中，仅有1例其20号外显子发生了2处错义突变，突变率为4.0％，其突变位点分别位于第791密码子2373碱基处（CAG→CAC）和第812密码子2436碱基处（CAG→CAT），氨基酸均由谷氨酰胺变为组氨酸（Gln→His），且都是杂合性突变，此例经免疫组织化学染色显示EGFR表达虽然为阴性，但患者术中即发现存在有远处转移，提示这两个位点发生的错义突变可能与结直肠癌的进展及预后相关。有4例患者（其中3例经免疫组织化学染色显示EGFR基因表达呈强阳性）检测出EGFR基因第20号外显子均发生了同义突变，且突变位点均相同，为第787密码子2361碱基处（Gln：CAG→CAA），可能亦提示这一同义突变的发生与结直肠癌EGFR的表达以及肿瘤的发生及发展相关。此外，还有1例患者其18号外显子第696个密码子2088碱基处发生同义突变（Glu：GAG→GAA），其免疫组织化学染色显示EGFR表达亦为阴性，而且在这一位点发生突变目前在国内外相关文献上还未见有相同的报道，可能是由于个体遗传特性的不同造成的，还需要大样本研究去进一步深入探讨与证实。对16例新鲜结直肠癌手术标本进行蛋白提取及定量，并通过Western印迹杂交法比较结直肠癌组织与癌旁正常组织中DNA-PKcs蛋白表达异同的实验结果显示，结直肠癌及癌旁组织均能与兔抗人DNA-PKcs多克隆抗体有特异结合活性，在460kD处可见有深染条带，而且结直肠癌组织标本DNA-PKcs蛋白的表达要高于癌旁正常组织（P=0.013）。结肠癌Colo205细胞经Hoechst33342和PI染色、荧光免疫细胞化学染色的结果显示，SP细胞的数目约占癌细胞总量的4-10％。SP细胞耐药蛋白的“药泵”作用可以把Hoechst33342染料泵出胞核而在荧光显微镜下呈低染或空染改变。SP细胞在DNA-PKcs中的表达明显强于其它癌细胞，在P16、NF-κB/P65及FHIT中的表达均弱于其它癌细胞，而在Id2中的表达与其它癌细胞无明显差异。结论1、NF-κB/P65、腹腔及远处转移情况以及术后是否采取放化疗等辅助治疗措施是结直肠癌无瘤生存时间的独立预后因子；NF-κB/P65、TNM分期、腹腔及远处转移情况以及术后是否采取放化疗等辅助治疗措施是结直肠癌总体生有时间的独立预后因子。2、生物标志物NF-κB/P65为阴性表达时，患者的无瘤生存时间较长，复发率较低。3、DNA-PKcs、P16、NF-κB/P65、FHIT及Id2均与结直肠癌的发生发展和（或）转移密切相关，上述生物标志物表达的变化可能对结直肠癌的演化和进展起重要作用，并可能成为新的临床辅助诊断和监测预后的指标。4、DNA-PKcs、NF-κB/P65、EGFR及Id2在结直肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织，而FHIT则相反。P16和Her-2在癌和癌旁正常组织表达的阳性率均无显著性差异。5、EGFR基因第18-21号外显子的突变可能与结直肠癌的转移相关。6、结肠癌Colo205细胞中SP细胞约占癌细胞总量的4-10％。SP细胞在DNA-PKcs中的表达明显强于其它癌细胞，在P16、NF-κB/P65及FHIT中的表达均较其它癌细胞明显减弱，而在Id2中的表达与其它癌细胞无明显差异。